[发明专利]一种检测microRNA的方法和试剂

说明书

本发明提供了一种检测microRNA的方法和试剂。该方法利用磁珠捕获microRNA得到模板，再将模板加入由具有线性引物和茎环引物的连接引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中进行荧光PCR检测。该方法可在一个反应体系中同时满足连接与扩增的需求，操作简单，特异性好，灵敏度高，可以实现一步法，简化了实际操作步骤，缩短了反应时间。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更为具体的是涉及一种检测microRNA的方法和试剂。

背景技术

快速准确的聚合酶链式反应已普遍应用于各类临床疾病的诊断治疗。该技术在耐热DNA聚合酶的作用下，通过循环温度的辅助，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，进行半保留复制。近年来，肿瘤疾病的发病率日益增加，而miRNA具有理想肿瘤标志物的特征，在癌细胞和组织中有特异性表达谱，且成熟的miRNA在血清、血浆或其他体液中均存在，大大增加了检测的可能性。因此，基于miRNA的生物标志物检测在往后的常规临床实践中会占据及其重要的位置。

传统的连接酶链式反应是将设计好的一对线性寡核苷酸探针杂交到目标DNA的相邻序列上，杂交后两条探针相邻但并未连接。在加入连接酶后，他们之间形成的缺口被连接酶所连接，形成一条完整的链，再由连接产物的引物来进行温度循环扩增，然后再将得到的产物进行检测。然而线性探针的结构简单，无空间约束去阻止其结合双链组DNA，又由于样本中干扰因素较多，无法保证结合的敏感性、特异性，且连接与检测无法一步进行，反应时间长，其实用性较低。综上所述，需建立一种简单、快速、高灵敏度与高特异性的miRNA检测方法。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种检测microRNA的方法和试剂。该方法利用磁珠特异性捕获microRNA模板，以磁珠为模板RNA载体，将捕获了RNA的磁珠加入以茎环引物、5’端具有Poly(A)尾的线性引物、扩增引物、连接酶以及扩增缓冲液组成的试剂中实现一步法，简化了实际操作步骤，缩短了反应时间，具有较高的灵敏度及特异性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测microRNA的试剂，检测试剂包括连接引物、扩增引物及探针。其中连接引物包括一条线性引物和一条茎环引物，扩增引物是microRNA经连接反应后生产的cDNA设计。

以靶标为模板设计两条连接引物A和B；

在靶标存在的情况下，引物A和引物B退火杂交到靶标上，经过连接酶的高效催化，引物A的3’端与引物B的5’端之间的缺口被连接，得到连接产物；

在连接产物中加入扩增引物、探针及DNA聚合酶后，经过重复循环变性-退火-延伸，得到荧光信号，从而实现对目标的检测。

优选的，所述引物A为一条线性引物，由一段Poly(A)尾结构序列以及一段与靶标3’端杂交的序列组成，引物A3’端含羟基；靠近3’端的碱基点为连接点；

优选的，所述引物B为一条茎环引物，由一段与靶标5’端杂交的序列及茎环结构序列组成，引物B 5’端进行磷酸化修饰；靠近5’端的碱基点为连接点；

优选的，其中一条扩增引物可在连接引物A的基础上进行设计，降低了引物设计的复杂性；

优选的，反应体系同时满足连接及扩增反应的进行。

本发明还提供了一种检测microRNA的方法，采用本发明所述试剂，包括以下步骤：样本处理，捕获作为反应模板的靶RNA；将反应试剂加入至PCR反应管中，所述反应试剂包括连接引物和扩增引物；向PCR反应管中加入步骤1中处理好的模板；启动连接扩增一步法反应程序；反应结束，进行结果分析。