[发明专利]一种腈水解酶突变体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种腈水解酶突变体、工程菌及其应用，所述突变体突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。本发明构建的突变体K200R/R224W/A229P催化苯乙腈产生的主产物为苯乙酸，占产物含量的96.3％，腈水合活性比K200R/R224W下降82.2％，有利于定向生成目的产物苯乙酸。对腈水解酶的反应专一性调控使其能够应用于酰胺和羧酸的绿色工业催化合成，具有重要意义。

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体及在合成苯乙酸中的应用。

(二)背景技术

腈化合物是一类含氰基的有机化工原料，广泛用于化工、医药、农药和材料工业。腈水解酶能够催化腈化合物水解生成羧酸，具有独特的化学选择性、立体选择性和区域选择性等优势，在腈化合物转化中发挥重要作用。一些腈水解酶除催化腈化合物水解生成羧酸外，同时具有腈水合活性。如Piotrowski等发现拟南芥腈水解酶同时具有腈水解和腈水合活性，能够催化β-氰基-L-丙氨酸转化为天冬酰胺和天冬氨酸，天冬酰胺的含量高达60％以上(J.Biol.Chem.,2001,276,2616-2621)。此外，Bradyrhizobium japonicum腈水解酶催化β-氨基丙腈水解，β-氨基丙酰胺的比例高达33％(J.Mol.Catal.B:Enzym.,2015,115,113-118)。

腈水解酶同时具有腈水解和水合活力的特性使其在生物有机合成中具有巨大潜力。提高腈水解酶的水解活性，专一性生成羧酸有利于产率的提高以及后期产物的分离纯化，为腈水解酶工业化生产提供便利。因此，腈水解酶反应专一性的调控对腈水解酶的工业化应用有着重要的意义。

随着基因工程技术的迅猛发展，通过分子改造可显著提高腈水解酶的活性、稳定性及底物特异性等催化性能。近年来，腈水解酶反应专一性的调控也成为研究热点。Gong等通过定点突变构建了双突变体I128L-N161Q，催化3-氰基吡啶时，产物中羧酸含量提高至99.1％，催化活力提高了1.98倍(Catalysis ScienceTechnology,2016,6(12):4134-4141)。DeSantis等对腈水解酶全基因序列进行饱和突变改造，获得了能够在3M底物浓度下高效催化3-羟基戊二腈的突变体，其产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸是阿托伐他汀的关键手性中间体(Journal of the American Chemical Society,2003,125(38):11476-11477.)。张焱等改造水稻(Oryza sativa)腈水解酶OsNIT，突变体K200R/R224W以苯乙腈为底物时，羧酸含量达到95.1％(CN111321132A)，但是突变体K200R/R224W腈水合活性依旧为野生型的22.74％。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高产羧酸的腈水解酶突变体、编辑基因、工程菌及应用，对OsNIT进行反应专一性调控，在保持水解活力的同时，提高羧酸含量，同时降低其水合活力从而降低酰胺含量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种腈水解活性专一性提高的腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQID NO.1所示氨基酸序列第200位、第224位、第229位、第246位进行单突变或多突变获得的。所述突变体可采用易错PCR、定点饱和突变及组合突变构建获得。所述SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

进一步，所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第145位半胱氨酸突变为天冬酰胺(C145N，氨基酸序列SEQ ID NO.4所示)；(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位赖氨酸突变为精氨酸、第224位精氨酸突变为色氨酸、第229位丙氨酸突变为脯氨酸(K200R/R224W/A229P，氨基酸序列SEQ ID NO.5所示)；(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第200位赖氨酸突变为精氨酸、第224位精氨酸突变为色氨酸、第246位天冬酰胺突变为缬氨酸(K200R/R224W/N246V，氨基酸序列SEQ ID NO.6所示)。