[发明专利]重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用

说明书

本申请公开了一种重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用。本申请中，编码吡喃糖氧化酶的分离的多核苷酸经密码子优化，且所述多核苷酸选自以下任一种：(i)具有如SEQ ID NO.1所示序列的多核苷酸；(ii)具有与如SEQ ID NO.1所示序列的同源性大于95％的多核苷酸；和(iii)具有与(i)或(ii)中所述的多核苷酸序列互补的多核苷酸。本发明通过密码子优化核酸序列，使得其适应大肠杆菌表达系统，生产周期短、产量高且产物活性高，本发明还通过可溶性标签的配合，使得产物可溶性好，易于分离纯化。

技术领域

本发明及生物技术领域，特别涉及重组吡喃糖氧化酶及其制备方法和应用。

背景技术

吡喃糖氧化酶(Pyranose Oxidase或简称PROD)是由担子菌纲的微生物产生的一类葡萄糖2位氧化酶，在以D-葡萄糖为底物，分子氧作为电子受体时呈现最高活性。它的分子量为70kD，是已知酶中较大的含黄素蛋白的酶，由623个氨基酸残基构成，目前在生物分子、食品或饮料行业、疾病诊断、生物过程监测和环境污染物筛选等方面都有应用(B.Perez-Lopez,A.Merkoci,Nanoparticles for the development of improved(bio)sensing systems,Anal.Bioanal.Chem.399(2011)1577–1590)，其中，PROD作为生物传感器主要是基于其有效氧化各种碳水化合物的能力(S.Timur,Y.Yigzaw,L.Gorton,Electricalwiring of pyranose oxidase with osmium redox polymers,Sens.Actuator.BChem.113(2006)684–691)。PROD是葡萄糖-甲醇-胆碱(GMC)氧化还原酶超家族中的一种非黄酮氧化还原酶(L.Sützl,C.Laurent,A.T.Abrera,G.Schütz,R.Ludwig,D.Haltrich,Multiplicity of enzymatic functions in the CAZy AA3 family,Appl.Microbiol.Biotechnol.102(2018)2477–2492)，通常在木材降解真菌中发现，它在细胞外与菌丝胞质周围空间的膜结合囊泡或其他膜结构相结合(G.Daniel,J.Volc,E.Kubátová,T.Nilsson,Ultrastructural and immunocytochemical studies on the H2O2-producing enzyme pyranose oxidase inPhanerochaete chrysosporiumgrown underliquid culture conditions,Appl.Environ.Microbiol.58(1992)3667–3676)。除真菌外，吡喃糖氧化酶还存在于放线菌纲、变形菌纲和杆菌类细菌中(P.L.Herzog,L.Sützl,B.Eisenhut,D.Maresch,D.Haltrich,C.Obinger,C.K.Peterbauer,Versatile oxidaseand dehydrogenase activities of bacterial pyranose 2-oxidase facilitate redoxcycling with manganese peroxidase in vitro,Appl.Environ.Microbiol.85(2019))。系统发育研究表明，PROD是唯一一种真菌和细菌共享的GMC酶(L.Sützl,G.Foley,E.Gillam,M.Bodén,D.Haltrich,The GMC superfamily of oxidoreductases revisited:analysis and evolution of fungal GMC oxidoreductases,Biotechnol Biofuels 12(2019)118)。