[发明专利]一种固定化蛋白酶Fe3

说明书

本发明公开了一种固定化蛋白酶Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备方法及其应用。其制备方法包括如下步骤：S1、水稻秸秆的改性处理，S2、Fe₃O₄磁性纳米粒子的改性处理，S3、固定化蛋白酶Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备；本发明首先对Fe₃O₄磁性纳米粒子进行改性处理，然后将木瓜蛋白酶(Papain)或胃蛋白酶(Pepsin)固定在Fe₃O₄磁性纳米粒子表面，蛋白酶固定在Fe₃O₄磁性纳米粒子表面后，其催化活性较高，酶解消化完成后，蛋白酶能快速的从消化产物中分离出来，并且蛋白酶和磁性纳米粒子能重复利用，不仅节省了蛋白酶的消耗，而且极大简化了后续酶解产物小片段的纯化工艺，本发明本着资源节约型和环境友好型理念，向改造传统的蛋白酶水解工艺迈出了关键的一步。

技术领域

本发明属于固定化蛋白酶制备技术领域，具体涉及一种固定化蛋白酶Fe₃O₄磁性纳米粒子的制备方法及其应用。

背景技术

在早期研究免疫球蛋白结构的过程中，人们常利用蛋白质的水解、还原、变性等实验技术来研究免疫球蛋白的化学特性。使用木瓜蛋白酶(Papain)消化免疫球蛋白，可以获得两种蛋白水解片段，即两个Fab单价抗原结合片段和一个Fc易结晶片段，其中，Fab片段能结合抗原，但不会发生凝集或沉淀，Fc则可以和细胞上的受体结合；使用胃蛋白酶(Pepsin)消化免疫球蛋白，可以获得一个F(ab’)₂片段和一个pFc’片段，其中，F(ab’)₂片段能结合抗原，可以发生凝集或沉淀，而pFc’片段没有生物活性。当使用上述木瓜蛋白酶(Papain)或胃蛋白酶(Pepsin)消化免疫球蛋白产生片段后，需要将游离酶和小片段进行分离和纯化，传统的纯化方法需要经过许多步骤，操作繁琐，同时纯化的产物纯度和收率均偏低，因此，急需要找到一个新的纯化工艺来解决上述技术问题。

磁性纳米粒子是纳米材料中的一种，不仅具有传统纳米材料的优良特性，同时具有较好的磁响应性和生物相容性，当粒径尺寸达到足够小时还具有良好的超顺磁性和高磁化等磁学性质。磁性纳米粒子优异的磁学分离特性可以使其在外界磁场的控制下方便快速地从复杂反应体系中分离纯化，也可以通过磁场诱导作用将磁性纳米粒子定向运输到指定目标位置。磁性纳米粒子因其制作方法简单、结构可控、良好的分散性和易修饰性等优异性能被广泛用于固定化酶载体，由于磁性纳米粒子独特的磁响应性，制备的固定化酶在外界磁场的控制下便于从反应体系中分离回收，可以显著提高固定化酶的重复使用和节约试验成本。

小尺寸效应使得磁性纳米粒子具有较大比表面积和较高的表面能，因此，磁性纳米粒子在反应介质中稳定性较差，通常会向表面能量降低的方向发展而使磁性纳米粒子发生团聚。此外，完全暴露在空气中的裸露磁性纳米粒子不稳定，容易被空气氧化和酸性介质溶解而失去磁性，这些不稳定因素严重限制了磁性纳米粒子的广泛应用。为了克服这些问题，通常的做法是对磁性纳米粒子表面进行修饰，降低磁性纳米粒子的表面能，使得它们之间的排斥力增加，因此可以尽量避免粒子团聚而具有较好的分散性，同时可以显著降低环境和反应介质对磁性纳米粒子的腐蚀作用；其次，采用适当的保护层可以引入功能化基团，使其可以与不同配体，如蛋白质、细胞等进行连接，制备多功能反应体系用于解决实际问题。

目前，已经有大量文献报道了以磁性纳米粒子为载体，将蛋白酶固定在该载体表面，用于催化或分离纯化，但存在着蛋白酶固定化后活性较低，固定化蛋白酶的固载量较低等问题。

发明内容