[发明专利]一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法及其应用

权利要求书

1.一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)样品预处理

将待测肽类产品用三氟乙酸溶液或磺基水杨酸溶液溶解，离心或过滤后取上清液，得到预处理后的样品溶液；

(2)凝胶色谱分离

①硅胶基质的凝胶色谱分离：采用硅胶基质的凝胶柱对步骤(1)中得到的预处理后的样品溶液进行色谱分离；其中，色谱分离的条件为：色谱柱：硅胶基质色谱柱；流动相：体积百分比30％～45％的乙腈和体积百分比0.15％～0.25％的三氟乙酸；紫外检测器的检测波长：220nm；流速：0.4～0.6mL/min；柱温：20～35℃；

或

②多糖型凝胶色谱分离：采用多糖型凝胶色谱柱对步骤(1)中得到的预处理后的样品溶液进行色谱分离；其中，色谱分离的条件为：色谱柱：多糖型凝胶色谱柱；流动相：50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0.15～0.25mol/L NaCl溶液，pH6.5～7.2；紫外检测器的检测波长：220nm：流速：0.4～0.6mL/min；柱温：20～35℃；

(3)中心切割

根据步骤①或②中的凝胶色谱分离结果进行流分切割收集，收集起点的相对分子质量为220，并依据最后一个色谱峰出完峰的时间确定结束收集时间，收集的次数为3～5次，合并流分再冷冻干燥，然后用pH 2.2的柠檬酸钠缓冲液溶解定容，膜过滤，得到待测游离氨基酸溶液；

(4)第二维色谱分离分析及紫外可见光检测：

将步骤(3)中得到的游离氨基酸溶液采用氨基酸自动分析仪或反相HPLC色谱进行分离，再采用紫外可见光进行检测，得到待测肽类产品中氨基酸的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的采用硅胶基质的凝胶色谱分离收集流分的时间为24.5min～30min；

步骤(3)中所述的采用多糖型凝胶色谱分离收集流分的时间为43min～54min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(4)中所述的第二维色谱分离分析及紫外可见光检测通过如下任一种方式实现：

(I)将步骤(3)中得到的游离氨基酸溶液利用氨基酸自动分析仪采用阳离子交换色谱分离模式进行分离，并采用柱后茚三酮衍生化，然后进行紫外可见光检测，获得待测肽类产品中氨基酸的含量；其中，紫外可见光检测的条件为：脯氨酸及羟脯氨酸的检测波长为440nm，除脯氨酸和羟脯氨酸以外的氨基酸的检测波长为570nm；

(II)将步骤(3)中得到的游离氨基酸溶液利用HPLC自动进样器进行柱前衍生化反应和自动进样，并经反相色谱柱分离后再进行紫外可见光检测，获得待测肽类产品中氨基酸的含量；其中，紫外可见光检测的条件为：脯氨酸及羟脯氨酸的检测波长为262nm，除脯氨酸和羟脯氨酸以外的氨基酸的检测波长为338nm。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

方式(II)中所述的柱前衍生化为OPA-FMOCL衍生化。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)①中所述的色谱柱为硅胶基质的凝胶柱TSK gel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；

步骤(2)①中所述的色谱柱为多糖型凝胶色谱柱Superdex peptide 10/300。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)①中所述的流动相为：体积百分比40％的乙腈和体积百分比0.1％的三氟乙酸；

步骤(2)①中所述的流速为0.5mL/min；

步骤(2)①中所述的柱温为25℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤(2)②中所述的流动相为：50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0.15mol/L NaCl溶液，pH7.0；

步骤(2)②中所述的流速为0.4mL/min；

步骤(2)②中所述的柱温为30℃。