[发明专利]一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法及其应用。本发明方法主要包括以下步骤：将肽类样品预处理、高效凝胶过滤色谱分离、中心切割即将色谱分离流分中游离氨基酸级分切割收集并浓缩、第二维色谱分离及衍生化反应，以及紫外可见光检测，以获得待测肽类产品中氨基酸的含量。本发明通过离线二维色谱分离和中心切割去除蛋白肽类食品配料样品中存在的主要成分即肽类对少量游离氨基酸检测的严重干扰，克服了肽的色谱峰与氨基酸的色谱峰重叠或部分重叠的问题，达到准确测定肽类产品中游离氨基酸含量的效果。

技术领域

本发明涉及游离氨基酸测定领域，特别涉及一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法及其应用。

背景技术

现有的作为食品配料的蛋白肽类产品的国家标准或行业标准(例如GB/T22729-2008)中关于肽含量的测定方法，均规定：肽含量＝酸溶蛋白含量-游离氨基酸含量。由于该类产品中主要成分是蛋白质的酶解产物，即相对分子质量大多为10000以下的肽类混合物，另外还含有少量游离氨基酸。按照现有肽类产品的国标或行标要求，此类产品中肽的含量一般至少70％以上，游离氨基酸含量一般大多为5％上下，至多10％～15％。其中，游离氨基酸含量的测定方法是按照相关肽类产品的国标或行标，将样品用5％TCA或3.5％磺基水杨酸处理后沉淀去除可能存在的大分子蛋白类成分，再采用以下两种色谱方法之一分离检测游离氨基酸，即方法1：采用GB5009.124-2016的规定的氨基酸分析仪方法，利用阳离子交换色谱法分离，再柱后茚三酮衍生化和紫外检测；方法2：使用柱前OPA和FMOC-CL衍生化后再反相色谱法分离，然后再紫外检测或荧光检测。

由于肽类样品中肽含量远大于游离氨基酸，故采用上述肽类国标或行标方法，为测定肽含量而采用氨基酸分析仪或柱前衍生化HPLC方法检测游离氨基酸含量时，由于肽类同样会发生衍生化反应，游离氨基酸的色谱峰会受到肽类的严重干扰，即两类物质的色谱峰大多会不同程度的重叠，导致游离氨基酸的色谱峰面积积分及其含量计算结果误差较大，加之不同实验室检测人员对重叠峰的切分方式不同，使得不同实验室结果的重现性也较差。因此，提出一种新的可较准确测定肽类产品中游离氨基酸含量的液相色谱测定方法，这对于尚不具备液相色谱-串联质谱分析氨基酸条件的质检机构检测肽类产品具有重要应用价值。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法。

本发明的另一目的在于提供所述基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于二维色谱分离测定肽类产品中游离氨基酸的方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理

将待测肽类产品用三氟乙酸溶液或磺基水杨酸溶液溶解，离心或过滤后取上清液，得到预处理后的样品溶液；

(2)凝胶色谱分离

①硅胶基质的凝胶色谱分离：采用硅胶基质的凝胶柱(凝胶粒)对步骤(1)中得到的预处理后的样品溶液进行色谱分离；其中，色谱分离的条件为：色谱柱：硅胶基质色谱柱；流动相：体积百分比30％～45％的乙腈和体积百分比0.15％～0.25％的三氟乙酸；紫外检测器的检测波长：220nm；流速：0.4～0.6mL/min；柱温：20～35℃；

或

②多糖型凝胶色谱分离：采用多糖型凝胶色谱柱对步骤(1)中得到的预处理后的样品溶液进行色谱分离；其中，色谱分离的条件为：色谱柱：多糖型凝胶色谱柱；流动相：50mmol/L磷酸盐缓冲溶液和0.15～0.25mol/L NaCl溶液，pH6.5～7.2；紫外检测器的检测波长：220nm：流速：0.4～0.6mL/min；柱温：20～35℃；

(3)中心切割