[发明专利]一种肠道病毒检测用试剂

说明书

本发明“一种肠道病毒检测用试剂”属于分子生物学技术领域，公开了一种基于RT‑PCR法，仅需一个PCR反应体系，便可将轮状病毒、诺如病毒和肠道腺病毒快速检测出的方法。该检测用试剂包含了：引物和探针：NR1‑F,NR1‑R，NR2‑F,NR2‑R,NR1‑P,NR2‑P,LZ‑F,LZ‑R,LZ‑P,CDV‑F,CDV‑R,CDV‑P，RP‑F1,RP‑R1,RP‑P2（以上引物及探针体积均为0.01μl‑1μl），溶剂为TE缓冲液。使用该方法以人类的管家基因作为内参，可对整个检测进行质量控制。该方法节省了核酸提取纯化的步骤，又有多重RT‑PCR的多联检技术，可在80分钟内迅速完成检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于RT-PCR法，仅需一个PCR反应体系，便可将轮状病毒、诺如病毒(GI和GII)以及肠道腺病毒（40和41）快速检测出的方法。

背景技术

病毒性腹泻最常见的病原主要由轮状病毒（Rotavirus, RV）、杯状病毒(HumanCalicivirus, HuCV)、肠道腺病（Enterovirus，EV）等的感染引起。

轮状病毒感染所占比例最大，轮状病毒，杯状病毒、肠道腺病毒是临床上病毒性腹泻感染的主要因素。

诺如病毒是人杯状病毒科诺如病毒属的一组病毒，常在学校、医院和孤老院等集体单位引起暴发，具有发病急、传播速度快等特点，涉及成人和儿童，是非细菌性腹泻暴发疫情的主要病原。

轮状病毒分为七种，分别用大写的英文A、B、C、D、E、F、G表示，其中A种是最为常见的一种，A种轮状病毒常导致儿童腹泻暴发，且表现为婴幼儿重症腹泻，治疗不及时易导致死亡;B种轮状病毒感染主要引起成人腹泻，上世纪80年代曾在我国造成百万成人腹泻的大流行。

这三种病毒引起的肠道感染症状与细菌性胃肠炎症状非常相似，主要为呕吐、腹泻、腹痛且均有较强的传染性。现有的检测为电镜法、免疫法和RT-PCR法。

电镜法有直接电镜法(EM)和免疫电镜法(IEM)两种检测方法，其中，EM 法观察的灵敏度较低，要求每毫升粪便样品中不能低于约 106个病毒粒子，因此只能用于患病早期病毒大量排出时采集的样本检测。IEM 法比 EM 法的敏感性可提高 100 倍，主要应用患者恢复期血清捕捉同型抗原，从而增加检出率。

电镜法的缺陷在于设备非常昂贵，操作很复杂，因此不能广泛普及；并且检测结果与操作者的技能和经验有直接关系；灵敏度相对较低；不适于大规模流行病学调查。

免疫法包括放射免疫法(RIA)、生物素-亲和素免疫法(Biotin-AvidinImmunoassay)和酶联免疫法(ELISA)。

法的灵敏度比IEM 法高10～100倍，可以检测出抗体升高的水平，为流行病学提供更有参考价值的资料。RIA 法的不足之处在于检测时间极长，约6天，且需要放射性同位素标记。后来，美国疾病预防控制中心建立了生物素-亲和素免疫法，其灵敏度与 RIA 法相当，目前该方法已成为美国疾病预防控制中心检测NLV抗原和抗体的标准实验方法之一。酶联免疫检测方法快速、灵敏、经济，其不足之处是免疫反应的株型特异性太强，所以应用范围比较窄。

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)除了能更准确、灵敏地检测标本中的病毒，尤其是低浓度的病毒感染，其最大的优点在于可以进一步对病毒进行基因型的研究，不会受到获得分型单克隆抗体的限制，对流行病学研究具有重要意义。同时，由于其超高的灵敏度，RT-PCR还可以检测食物中存在的病毒粒子。但目前的检测还仅限于单个病毒的PCR检测，不仅增加了操作步骤，还提高了检测成本。

综上所述，上述技术方案实际使用上显然存在明显缺陷与不便，所以有必要加以改进。

发明内容