[发明专利]一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗及其构建方法与应用。合成5’端依次为体外T7（或S6）转录启动子、脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点IRES、N6‑甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒ISKNV主要衣壳蛋白MCP开放读码框的融合序列P‑IRES‑m6A‑MCP，以P‑IRES‑m6A‑MCP为模板，用T7（或S6）转录酶体外转录RNA，用DNaseI去除DNA模板后，用T4 RNA连接酶连接环化，用RNase R酶去除线性RNA后获环状RNA，即circRNA‑MCP。该circRNA‑MCP免疫注射后可减少传染性脾肾坏死病的发生。

技术领域

本发明涉及到基因工程技术领域，具体涉及一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建。

背景技术

目前，常见的疫苗主要有：灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、合成肽疫苗、重组活载体疫苗、DNA疫苗以及mRNA疫苗等，不同类型的疫苗各有优缺点。传统的减毒疫苗可以激活体液免疫和细胞免疫，但这种类型的疫苗有回复致病性的潜在危险，安全性较差；相对于减毒疫苗，亚单位疫苗安全性好，但诱导细胞免疫排除胞内病原方面效果较差；由于疫苗抗原原位表达，基于病毒载体和核酸（质粒DNA和mRNA）的新的疫苗技术能诱导体液和细胞毒性T细胞免疫反应。mRNA 疫苗属于核酸疫苗，是继减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗之后发展起来的第三代疫苗。随着mRNA合成、修饰、传递技术的发展，已证实mRNA注射动物后可发挥疫苗的作用。由于mRNA疫苗无整合宿主基因组风险，无微生物污染，同时可诱导细胞和体液免疫应答，且研发时间短，成本低，易标准化生产，近些年来成为疫苗研发的热点。然而，mRNA疫苗稳定性差，极容易降解，通常需超低温保藏运输，在应用上受到了很大的限制。circRNA 是一种无5'端帽子结构和3'-poly(A)尾巴的闭合环状单链RNA分子，不易被RNaseR和核酸外切酶降解，具有mRNA疫苗优势的同时，可弥补mRNA疫苗的劣势。

鳜（Siniperca chuatsi）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）是水产养殖业中的珍贵品种，但往往因传染性脾肾坏死病毒（Infection spleen and kidney necrosisvirus，ISKNV）感染而导致严重损失。免疫技术在鱼类病害防治中日益成为一种安全、有效、环保的新型防控技术。在我国传染性脾肾坏死病灭活疫苗已取得新兽药注册证书（一类），该疫苗是在体外通过病毒感染敏感细胞系获取ISKNV，进一步对ISKNV灭活获得。由于灭活疫苗的免疫持久力差，使用时免疫剂量大从而影响其使用效果和覆盖面。因此，养殖生产中希望有新型疫苗供选择使用。

发明内容

抗传染性脾肾坏死病毒的灭活疫苗的免疫持久力差，使用时免疫剂量大从而影响其使用效果和覆盖面，由于mRNA疫苗无整合宿主基因组风险，可同时诱导细胞和体液免疫应答，且研发时间短，成本低，易标准化生产，近些年来成为疫苗研发的热点。但mRNA疫苗稳定性差，极容易降解而影响使用效果。本发明的目的是提供一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA疫苗的构建，发挥mRNA疫苗优势的同时，弥补mRNA疫苗的劣势，为鳜、大口黑鲈传染性脾肾坏死病的免疫防治提供新的选择。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种抗传染性脾肾坏死病毒的circRNA分子的构建方法，包括下列步骤：

（1）合成5’端依次为体外转录启动子、内部核糖体进入位点IRES、N6-甲基腺嘌呤m6A位点、传染性脾肾坏死病毒开放读码框的融合序列（P-IRES-m6A-MCP）；

（2）将P-IRES-m6A-MCP序列克隆进载体，获重组质粒pP-IRES-m6A-MCP；

（3）pP-IRES-m6A-MCP酶切后回收P-IRES-m6A-MCP片段或以pP-IRES-m6A-MCP模板PCR扩增P-IRES-m6A-MCP片段；

（4）以P-IRES-m6A-MCP片段为模板，进行体外转录，然后消化去除DNA，获体外转录的RNA；