[发明专利]一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，先对Taq DNA聚合酶逐步进行封闭修饰、化学修饰、核酸适配体修饰后，在对修饰后的Taq DNA聚合酶酶液进行QHP离子交换层析，洗脱梯度分成三步洗脱，2～8℃层析柜内纯化。通过以上方法获得的热启动Taq DNA聚合酶，能够很好的分离出修饰过程中未被修饰的Taq DNA聚合酶，保证在后续PCR实验中不会因为存在没被封闭的酶导致的非特异性扩增；同时除去了未参与修饰的修饰剂，减少了修饰剂对PCR扩增的影响。

技术领域

本发明涉及DNA聚合酶技术领域，具体为Taq DNA聚合酶的制备方法。

背景技术

Taq DNA聚合酶在75℃～80℃时活性最高，但是在温度较低时，该聚合酶的活性也依然存在。这就使得在PCR反应的初始阶段，由于引物的量比模板的量高出很多，在仪器升温过程中，很容易出现引物互搭或引物与模板中的一些非靶位点错配的现象，在DNA 聚合酶的作用下进行延伸，形成引物二聚体和非特异性产物。这些引物二聚体和非特异性产物又可作为引物或模板在以后的PCR循环中继续扩增，使非特异产物不断扩增和累积。如果PCR的循环数较多、扩增子的GC含量较高以及多重PCR体系，也很容易产生引物二聚体和非特异性产物，既降低了目的产物的扩增效率，又影响PCR在检测及测序等方面的应用。

所以在PCR实验中往往使用活性被封闭的热启动Taq酶，但在对Taq DNA聚合酶进行修饰封闭活性的过程中，如果加入的修饰剂的量不合适会导致修饰结果的失败，加入修饰剂的量少会导致封闭不完全，进行PCR扩增时出现非特异性扩增，加入的修饰剂量多则因为大量修饰剂(马来酸酐、柠康酸酐、抗体、适配体)的存在对产物扩增造成负面影响。

专利CN 103966184 A中通过人工合成的亲和配体多肽来修饰Taq DNA聚合酶，但该方法没有显示如何除去多余的多肽以及如何确保被修饰的Taq DNA聚合酶全部转化为热启动Taq DNA聚合酶。

专利CN 110283801 A中通过加入同等体积的1％BSA除去化学修饰中残余的修饰剂，该方法不能确保完全除去过剩的修饰剂，也不能确保所有的Taq酶都是被修饰过的热启动酶。

专利CN 105368800 A中谈到了通过Taq DNA聚合酶的氨基与醛基化多聚糖的醛基反应形成酰胺键实现酶活封闭，也谈到了分离产生的热启动Taq DNA聚合酶，但是并未展现如何分离产生的热启动Taq DNA聚合酶，也没有告知如何除去没有参与反应的醛基化多聚糖。

发明内容

基于上述情况，我们公开了一种Taq DNA聚合酶的制备方法，解决上述技术问题。

本发明能够很好的分离出修饰过程中未被修饰的Taq DNA聚合酶，保证在后续PCR实验中不会因为存在没被封闭的酶活导致的非特异性扩增；同时除去了未参与修饰的修饰剂，减少了修饰剂对PCR扩增的影响。

本发明还可适用于任意一种可以进行酶活封闭操作的聚合酶，例如kofu DNA聚合酶或者Bst DNA聚合酶。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤，

步骤一：对Taq DNA聚合酶进行酶活封闭，具体包括以下步骤，

选择5U/uLTaq DNA聚合酶酶液，按照体积比1：99加入1％酸酐修饰液，磁力搅拌器混匀后，室温放置30分钟，4℃静置16小时；

步骤二：对Taq DNA聚合酶进行抗体修饰，具体包括以下步骤，

将步骤一中修饰后的Taq DNA聚合酶酶液和抗Taq DNA聚合酶抗体分别以体积为1： 1体积旋涡混合均匀，室温放置30分钟后，置于4℃静置16小时；

步骤三：对TaqDNA聚合酶核酸适配体修饰，具体包括以下步骤，