[发明专利]一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用。该探针基于EPR自旋技术高度的特异性，以Trityl自由基为报告基团，Cu(II)络合物为识别基团，构建一种基于Trityl‑Cu(II)结构的新型的用于检测HNO的EPR探针。Trityl‑Cu(II)结构中均因分子内有较强的自旋‑自旋相互作用呈现宽EPR信号；与HNO反应后会导致顺磁性Cu(II)的转变成无顺磁性的Cu(I)，产生具有狭窄EPR信号。本发明利用反应前后EPR信号强度变化(EPR信号从弱到强，EPR信号无重叠，提高检测准确性和灵敏性)以及反应动力学理论实现高效检测HNO。因此在HNO检测方面具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其是涉及一种利用EPR成像技术检测HNO的探针，具体涉及一种用于检测HNO的EPR探针及其制备方法与应用。

背景技术

亚硝酰氢(Nitroxyl，HNO)是一氧化氮(NO)的单电子还原并质子化的衍生物，是生物体内重要的活性氮物种，在生命体的生理和病理过程中起着关键性作用。HNO所具有的生理和病理作用特征与NO迥然不同，主要体现在调节心血管系统、免疫系统和神经系统等方面，包括：与蛋白质上的巯基直接反应从而抑制乙醛脱氢酶的活性；通过激活哺乳动物的血管系统中电压控制的钾离子通道调节心血管功能；增加正常及心力衰竭时心肌的收缩力，同时改善心肌舒张功能，抑制血小板聚集；与细胞内抗氧化清除剂硫醇直接发生反应，进而调控生物体内的氧化/还原态环境；具有抗肿瘤活性和抗炎活性。但是HNO水平过高会加剧缺血再灌注损伤并导致神经毒性。尽管有关HNO生物活性的研究不断被报道，但是内源性HNO产生的具体途径及病理生理功能仍未明确。且生物体内HNO浓度较低，活性较高，能够自发形成二聚体并脱水形成N₂O，其精准检测成为生物医学领域的关键技术难题。

当前普遍使用的荧光检测法虽然具有高灵敏性、高分辨率等优点，但是由于荧光背景信号干扰强和组织不充分的光穿透性等问题同样限制了荧光检测法在活体的使用。相比之下，核磁共振(NMR)和电子顺磁共振(EPR)具有极好的组织穿透性能力，因此在活体成像方面有巨大的应用前景，但是核磁共振(NMR)缺乏特异性，且容易受到其他自旋核的干扰、灵敏性较低等，这些缺点限制了其在活体方面的适用性。

电子顺磁共振(EPR)是专门检测和表征顺磁性物质的独特技术，对自由基检测具有高度的特异性。EPR联合顺磁性探针可定性、定量检测或成像生理参数如pH、分子氧、氧化还原态和活性氧等。EPR具有以下优点：与NMR相比，EPR对探针分子的检测浓度高3个数量级；同时对检测体系无干扰、无创性、高选择性且可重复连续检测等优点，适用于体外及活体监测和成像；最近发展的低场EPR技术已经实现器官以及小动物的活体检测。EPR探针在HNO检测方面的研究逐渐受到国内外学者的广泛关注。

目前，基于EPR探针的活性氮检测技术逐渐成为分析方法中比较热门的领域，但是近些年来尚无该类型探针报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高选择性和高灵敏度的HNO的识别EPR探针。

本发明的第一个方面，提供一种EPR探针，该探针具有如下结构式：

式中黑点表示自由基。

本发明的第二个方面，提供所述EPR探针的制备方法，包括以下步骤：

将所述化合物TD1溶于无水乙醇中，滴入CuCl₂.2H₂O乙醇溶液，室温反应1-1.2h，反应结束后加入正己烷，析出蓝绿色固体，即所述EPR探针；所述化合物TD1与CuCl₂.2H₂O的摩尔比为1∶1，所述化合物TD1具有如下结构式：

进一步的，所述化合物TD1由以下步骤制备而成：