[发明专利]一种评估抗原沉默效应对抗体药效影响的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种评估抗原沉默效应对抗体药效影响的方法，包括以下步骤：1.将待测抗体经过抗原沉默处理；2.将表达TAA靶点的肿瘤细胞经过CFSE染色后与经过抗原沉默处理的抗体溶孵育，并分析抗体在细胞表面结合的平均荧光强度。本发明方法提高了实验信号窗口，显著地评估了抗原沉默效应对抗体作用的影响，同时更真实地模拟了针对实体肿瘤细胞的抗原沉默效应，在实体肿瘤治疗性抗体的研发中有更广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种评估抗体药效的方法，具体涉及一种评估抗原沉默效应对抗体药效影响的方法。

背景技术

针对某些在肿瘤细胞表面高表达的蛋白抗原开发治疗性抗体是目前常见的一种药物研发形式。然而，有相当一部分能够成药的蛋白抗原除了在肿瘤细胞表达之外，在血液细胞或正常组织细胞中也有表达。因此当抗体药物进入体内后，会结合表达其所对应抗原的血液细胞或正常组织细胞等非肿瘤细胞，从而影响抗体药物在体内的分布和消除，限制抗体药物靶向到预期作用的目标组织，这种现象称之为抗原沉默效应(Antigen Sink)。因此在研发阶段能有效评估抗原沉默效应对抗体药效的影响具有重要意义。

白细胞分化抗原47(Cluster of Differentiation 47,CD47)最初发现在红细胞中有表达，后发现几乎所有正常组织细胞中都有不同程度的表达，作为一种天然免疫检查点来调控对于细胞的吞噬作用。CD47是一个52kD糖蛋白，具有免疫球蛋白可变的N端结构域、5个跨膜结构域和一个短的C端胞内结构域。正常组织细胞表面的CD47能够与巨噬细胞表面的受体信号调节蛋白(Signal Regulatory Protein alpha,SIRPα)相互作用，启动SIRPα下游的抑制性信号通路，从而阻断巨噬细胞对于正常细胞的清除。但是这种机制同样会被肿瘤细胞所利用，因此开发靶向CD47的抗体药物来阻断CD47-SIRPα信号轴，恢复巨噬细胞对于肿瘤细胞的吞噬作用，起到抗肿瘤的治疗效果，具有很好的临床应用前景。然而，某些正常组织细胞，特别是红细胞和淋巴细胞上的CD47表达量较高，会对抗体药物产生较为明显的抗原沉默效应，从而影响抗肿瘤的治疗效果。

发明内容

本发明的目的在于，建立一种评估待测抗体抗原沉默效应的方法，通过将靶向CD47的待测抗体与表达CD47的非肿瘤细胞进行预孵育来模拟抗原沉默过程，并进一步评价对抗体对实体肿瘤细胞的生物学功能的影响，可以作为此类药物早期研发过程中的一种有效措施。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种评估抗原沉默效应对抗体药效影响的方法，包括以下步骤：

1.抗原沉默效应对抗体与细胞结合的影响

我们用去除血浆的人全血来模拟红细胞，用Jurkat细胞来模拟T淋巴细胞。

待测抗体用1％(体积比)BSA-PBS稀释，从300nM开始，3倍稀释至0.0051nM，共11个点。去除血浆的人全血用1％BSA-PBS进行10倍稀释，Jurkat细胞系用1％BSA-PBS重悬成1.2×10⁷个/mL的密度。将10倍稀释的血液细胞溶液或Jurkat细胞悬液接种到96孔圆底培养板中，每孔加入100ul，离心后甩走上清，每孔加入100ul稀释好的抗体溶液重悬，于4℃孵育1小时，离心后再将上清转移到新板中备用，即为经过抗原沉默处理的抗体溶液。

表达TAA靶点的肿瘤细胞经过CFSE染色后，用1％BSA-PBS重悬成0.8×10⁶个/mL的密度，接种到96孔圆底培养板中，每孔加入100ul，离心后甩走上清，每孔加入100ul经过抗原沉默处理的抗体溶液重悬，于4℃孵育1小时，洗两遍后，每孔加入100ul荧光标记的二抗溶液重悬，于4℃避光孵育半小时，洗两遍后，用1％BSA-PBS重悬进行流式检测，圈出CFSE阳性的肿瘤细胞群，并用FlowJo软件分析抗体在细胞表面结合的平均荧光强度。

2.抗原沉默效应对抗体阻断SIRPα与细胞结合的影响