[发明专利]一种DNA直接扩增试剂及其应用

说明书

本发明提供了一种DNA直接扩增试剂及其应用。具体地说，本发明提供了一种核酸释放剂，包含多铵、N,N‑二甲基甲酰胺、酒石酸和Brij 30等。本发明还提供了一种直接扩增试剂，包含硫酸铵、BSA、DNA聚合酶和聚(4‑苯乙烯磺酸‑共聚‑马来酸)钠盐等。本发明还提供了包括用于配制所述核酸释放剂和/或直接扩增试剂的试剂的试剂盒和采用所述试剂盒对生物样本的DNA进行定量或定性分析的方法。本发明可以对多样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。本发明可以在室温条件下快速、有效释放液体样本的DNA，固体组织样本也无需过夜消化并进行核酸提取，所得粗样本可直接用于PCR扩增，无需核酸提取步骤，大大提高了检测效率。

技术领域

本发明涉从粗样本直接扩增核酸，尤其涉及从多种样本中直接扩增DNA的试剂及其应用。

背景技术

分子直扩又称Direct PCR技术或免提取扩增技术，它能够将原始未经DNA提取与纯化的样本直接加入PCR反应体系并获得扩增产物，减少检验步骤，降低检验成本，是PCR技术的一种。在该项技术出现之前，样品的预处理是科研人员难以避免并头疼的一项工作，动植物组织样本的研磨、核酸的提取与纯化步骤多、时间长，不仅容易造成样本的交叉污染、降解，还会增加实验的试剂、仪器和时间成本。

对于生物样本快速高效检验而言，分子直扩无疑是一个巨大的革命性进步。然而，实际应用过程中发现，采用传统的直接扩增试剂并不能得到理想的实验结果。其主要的原因是生物样本通常伴随着大量的PCR抑制剂释放至PCR体系中，使DNA聚合酶活性降低或者失活，从而严重降低PCR效率甚至导致假阴性结果的产生。研究人员建立通过添加不同PCR增强剂或使用具有抗抑制能力的聚合酶配合多种不同直接扩增试剂体系，很多商业化直接扩增试剂也先后被推出并应用于实践。随着技术的不断演进和发展，分子直扩已经实现了第一代PCR的直接扩增，但是对基于第二代荧光定量PCR的直扩技术还未有深入研究和突破。

中国专利CN 112662779 A公开了一种直接扩增检测口腔肿瘤基因生存相关的引物组、试剂盒及其方法，虽然流程已经减少，但是依然需要对组织样本进行蛋白酶K消化和过柱纯化等步骤。

中国专利CN113444771A公开了一种适合DNA或RNA病毒直接扩增的裂解剂、试剂盒及其在病毒PCR检测中的应用，其本质是发明了一种对于病毒样本的裂解试剂，只能处理拭子、病毒培养物等较为简单的样本，且其裂解剂组分主要为Tris-HCl、离液盐、表面活性剂、还原剂、EDTA及RNA酶抑制剂Rnasin，我们清楚地知道商品化qPCR Mix大都不能耐受离液盐、还原剂和EDTA，因此其发明的裂解剂应用领域将非常受限。

综上所述，虽然现有技术中不能提供完整的方案或方法能解决多种类型样本(血液、唾液、拭子、动物组织和植物组织等)的基于第二代荧光定量PCR的DNA直接扩增的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以对多样本中的DNA进行荧光定量PCR的直接扩增技术。本发明的方案包含一种针对多种生物类型样本的核酸释放剂和2X Direct qPCRMaster Mix。

本发明在第一方面提供了一种核酸释放剂，所述核酸释放剂可以快速释放多种生物类型样本中的DNA且去除绝大部分PCR抑制剂。

具体地说，本发明的核酸释放剂包含：多铵、还原剂、N,N-二甲基甲酰胺、酒石酸、十二烷基二苯醚二磺酸钠、Brij 30和水。

优选的是，所述核酸释放剂包含：10-200mM多铵、1-10mM还原剂、1-20％N,N-二甲基甲酰胺、0.1-10mM酒石酸、0.01-0.5％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.01-5％Brij 30和余量的水。

优选的是，所述核酸释放剂包含：20-100mM多铵、2-5mM还原剂、2-10％N,N-二甲基甲酰胺、0.2-5mM酒石酸、0.02-0.2％的十二烷基二苯醚二磺酸钠、0.05-2％的Brij 30和余量的水。