[发明专利]MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法及其筛选的多糖组方与多糖组合物的应用

权利要求书

1.MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法，其特征在于，所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法包括如下步骤：

(1)用含特异性抗原及荧光蛋白的重组质粒转染肿瘤靶细胞，转染后加入抗生素筛选，持续药筛后，荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况；经过单克隆扩培、流式细胞分选，得到表达特异性抗原的可视化肿瘤靶细胞；

(2)分离小鼠免疫脏器组织，研磨以及裂解红细胞后，获得免疫效应细胞的单细胞悬液；

(3)肿瘤靶细胞铺板贴壁后，加入免疫效应细胞，同时加入待筛选物，进行共培养。

2.根据权利要求1所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含特异性抗原及荧光蛋白的重组质粒为pLVX-IRES-tdTomato-N4重组质粒；所述肿瘤靶细胞包括：LLC小鼠肺癌细胞、MC38小鼠结肠癌细胞、B16小鼠黑色素瘤细胞或GL261小鼠胶质母细胞瘤细胞中的一种以上；所述抗生素包括嘌呤霉素、青霉素或链霉素中的一种以上；所述抗生素的浓度为1-10μg/mL；所述药筛的时间为4-15天。

3.根据权利要求1所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述小鼠包括OT-I或OT-II小鼠；所述脏器包括脾脏、胸腺或淋巴结中的一种以上；所述免疫效应细胞为OT-I全脾脏免疫效应细胞。

4.根据权利要求1-3任一项所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述免疫效应细胞与肿瘤靶细胞的细胞个数比例为(100-1)：1，步骤(3)所述共培养的时间为12-96h。

5.权利要求4所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方，其特征在于，所述多糖组方组成原料包括有：姬松茸、灰树花、陈皮、桑黄、灵芝、茯苓、当归和枸杞中的一种以上，所述多糖组方为姬松茸多糖、灰树花多糖、陈皮多糖、桑黄多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、当归多糖和枸杞多糖中的一种以上，所述多糖组方的免疫调节功能筛选评价包括：(1)肿瘤细胞与免疫细胞共培养后，胰酶消化，混合细胞收集于流式管中，离心后重悬细胞，检测肿瘤靶细胞的数量，根据肿瘤靶细胞的死亡率筛选得到多糖组合物；(2)使用Cytation7高通量活细胞成像系统对共培养细胞进行高通量荧光成像筛选，根据肿瘤细胞荧光数量的变化筛选得到多糖组合物。

6.根据权利要求5所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方，其特征在于，所述多糖组方中的姬松茸多糖、灰树花多糖、陈皮多糖和桑黄多糖的质量份数比为(1-125)份：(1-125)份：(1-25)份：(0-25)份。

7.根据权利要求5所述MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法筛选的多糖组方，其特征在于，所述使用Cytation7高通量活细胞成像系统对共培养细胞进行高通量荧光成像筛选，用于筛选和评价具有免疫调节活性的物质；所述检测通过荧光成像可视化。

8.权利要求5所述多糖组合物的应用，其特征在于，所述多糖组合物在制备增强CD8⁺T细胞抗肿瘤免疫记忆作用、增强机体免疫活性以及促进抗肿瘤功效的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述多糖组合物的应用，其特征在于，所述增强机体免疫活性主要在于提高CD8⁺T细胞的存活率以及CD8⁺CD62L的比例。

10.根据权利要求8所述多糖组合物的应用，其特征在于，所述促进抗肿瘤功效主要在于提高免疫细胞对含特异性抗原的肿瘤细胞的杀伤效果。