[发明专利]MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法及其筛选的多糖组方与多糖组合物的应用

说明书

本发明公开了MC38‑N4/OT‑I共培养系统筛选方法及其筛选的多糖组方与多糖组合物的应用。基于该筛选方法得到多糖组合物的步骤包括：获得含特异性抗原和荧光蛋白的肿瘤靶细胞、分离免疫效应细胞、共培养肿瘤靶细胞与免疫效应细胞、评价多糖组方的免疫调节功能。本发明提供的共培养筛选方法，其优点在于：基于肿瘤微环境的特点模拟了肿瘤细胞和与免疫细胞的相互作用过程，兼具应用范围广、实验结果可视化、高通量筛选等特点。本发明提供的多糖组合物，其原料包括姬松茸、灰树花和陈皮，该组方具有改善机体免疫功能、增强抗肿瘤功效等，可用于免疫增强相关产品的开发，为食源性多糖组方应用于临床免疫增强药物提供实验基础和科学依据。

技术领域

本发明属于功能食品技术领域，具体涉及MC38-N4/OT-I共培养系统筛选方法及其筛选的多糖组方与多糖组合物的应用。

背景技术

肿瘤的发生、生长及转移与肿瘤细胞所处的内外环境密切相关。肿瘤微环境(Tumor micro-envirnment，TME)是指肿瘤细胞存在的周围微环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性细胞、各种信号分子和细胞外基质。近年来，免疫疗法由于能有效刺激宿主免疫系统，促进肿瘤微环境中免疫细胞杀死癌细胞，因此在癌症治疗中已经发展成为继手术、化疗、放疗之后的第四种抗肿瘤治疗手段。研究发现，天然多糖具有较强的预防肿瘤发生和抑制肿瘤的作用，且与传统的肿瘤治疗方法相比，天然多糖具有低毒和调节免疫的优点。食源性天然多糖不仅对大多数机体细胞都没有明显毒性，并且能刺激各种免疫活性细胞的增殖、分化和成熟，使机体的免疫系统得到恢复和增强，从而被公认为是一种重要的生物效应调节剂。因此寻找可以长期食用且副作用较小的食源性活性多糖对于肿瘤患者来说具有重大意义。

目前筛选免疫调节活性物质的动物模型主要包括：异种移植模型、同源移植模型、基因敲除模型、基因工程小鼠模型和人源基因敲入模型等。相比于动物模型，体外细胞模型具有实验周期短、筛选通量高等优点。体外筛选免疫调节活性物质的模型主要有RAW264.7细胞极化模型、2D共培养模型、类器官和微流控细胞模型等。理想的多糖筛选体外试验应较为接近地模拟体内的肿瘤微环境，以高灵敏度和特异性进行免疫治疗的高通量筛选，以便对预期有效药物进行进一步试验。RAW264.7细胞极化方法无法真实模拟肿瘤微环境中细胞之间复杂的相互作用过程；类器官模型虽广泛用于癌症活检组织培养，但通常也只包含肿瘤细胞而不包含免疫细胞。与单细胞体外筛选模型相比，共培养细胞模型是更复杂、更具生物相关性和预测性的细胞筛选法，共培养模型因能更好地模拟体内环境和对药物治疗的反应，所以更适用于化合物的筛选。基于肿瘤微环境的多细胞的性质，肿瘤细胞和免疫细胞共培养模型能模拟肿瘤微环境中细胞间的相互作用，可用于体外测试免疫疗法以及免疫制剂的功效。

目前也需要开发更有效的体外细胞毒性检测方法，通过量化肿瘤微环境中的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，评估筛选物在肿瘤微环境中的免疫调节功效。其中，⁵¹Cr释放试验是最常见的体外检测方法，通常被用于测量T细胞介导的细胞毒性作用，但该实验具有放射性毒性，应用受到限制。Pimentel等研究提出利用萤火虫荧光素酶试验评估肿瘤细胞的靶向杀伤死亡率，该方法实验过程繁琐，不仅需要加反应底物，而且由于反应时间短需要快速检测，实验结果不能可视化，因此难以满足实验大规模筛选的需求(Olivo PimentelV,Yaromina A,Marcus D,Dubois LJ,Lambin P.A novel co-culture assay to assessanti-tumor CD8+T cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flowcytometry.J Immunol Methods.2020Dec；487:112899.doi:10.1016/j.jim.2020.112899.Epub 2020Oct 15.PMID:33068606.)。对肿瘤细胞转染荧光蛋白，在保证没有放射性毒性的同时，用显微成像和高内涵、高通量分析工具自动成像肿瘤靶细胞，从而实现共培养中肿瘤细胞的可视化，并可视化检测共培养中免疫细胞的杀伤作用。