[发明专利]快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法

说明书

本发明属于生物技术领域，特别涉及快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法，本发明的试剂盒包括：引物、探针、核酸释放试剂、PCR缓冲液、对照品、标准品和内标等物质。利用本试剂盒可以对乙型肝炎病毒9个基因型(A～I)进行荧光定量检测，使用本试剂盒不需要提取血清中乙型肝炎病毒核酸，整个反应在同一PCR管中即可完成，减少换管过程中待检标本受污染的机会。本发明还解决了5G Polymerase酶不能直接进行血清乙型肝炎病毒核酸扩增的技术问题。本试剂盒的最低检出限为30IU/ml，具有灵敏、特异、准确、快速、操作简便等优势，可以大大提高对乙型肝炎病毒的检出效率。

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，特别涉及快速检测乙型肝炎病毒9个基因型的引物、探针、试剂盒和方法。

【背景技术】

乙型肝炎病毒(HBV)属于嗜肝病毒科，全世界三分之一人口(约20亿人)曾经感染过HBV，目前仍有约2.57亿慢性HBV携带者，我国至少还有9千万慢性HBV携带者。慢性HBV感染可导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌等各种肝脏疾病，每年约88万人死于与HBV感染有关的肝脏疾病。虽然大规模推广新生儿乙肝疫苗免疫接种效果显著，但仍然有约5％的免疫失败，而且，在乙肝疫苗长期免疫效果观察中已发现疫苗免疫成功、抗体滴度下降后慢性感染HBV现象。可见，慢性HBV感染仍然是全球性的公共卫生问题。

虽然HBsAg是HBV感染的重要血清标记物，但不能直接反映感染者体内病毒复制情况，不能说明感染者传染性大小，而血清HBV DNA浓度(病毒载量)具有这方面作用。病毒载量是影响母婴传播最重要的危险因素，对病毒载量≥10⁶拷贝/ml、HBsAg和HBeAg双阳性孕妇发生母婴传播风险最高，因此，产前检测HBV病毒载量才能评估这类孕妇是否需要产前抗病毒治疗，降低病毒载量、减少母婴传播风险。过去认为，HBV感染者HBeAg阴转即表示病毒不复制、无传染性，但最近研究发现，HBV基因突变(nt1896 G→A,nt 1762A→T和1764G→A)可导致HBeAg阴性，这类感染者病毒仍在复制，仍具有传染性。病毒载量大于≥10⁴拷贝/ml的慢性HBsAg无症状携带者肝癌风险增高，抗病毒治疗以降低病毒载量可降低肝癌风险，因此，这类感染者需要进行HBV病毒载量监测。很多抗肿瘤药物均可抑制人体免疫，因此，HBsAg阳性的肿瘤患者用抗肿瘤药物前，都要进行HBV病毒载量检测以评估是否需要先行抗HBV治疗，否则，抗肿瘤药物可能激发HBV大量复制、繁殖，威胁生命。可见，检测HBV病毒载量意义重大，应用广泛。

根据全基因组核苷酸序列差异≥8％原则，目前已发现HBV有9个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H、I基因型)，根据型内S基因核苷酸序列差异≥4％，每个基因型还可细分多个亚型，目前已发现55个基因亚型。

HBV病毒载量检测基本步骤是核酸提取后扩增。提取核酸的目的是去除可能减少病毒DNA扩增能力和降低扩增效率的抑制物，然而，各种核酸提取方法复杂，繁琐，耗费人力、耗时、费用高、很容易导致待检标本污染。

目前已有多种国产乙型肝炎病毒实时荧光定量PCR试剂盒用于临床检验、卫生检验和科研检测，但只能检测出HBV 8个基因型(A、B、C、D、E、F、G、H基因型)，因此，有必要研制能同时检测出包括最近发现的第九种基因型I的试剂盒。另外，申请人在研究过程中，应用目前我国自主研发、最好的DNA聚合酶之一5G Polymerase进行血清HBV DNA直接扩增实验，发现使用该聚合酶及其配套的缓冲溶液进行血清直接扩增，效果差，结果不可靠，需要先提取病毒DNA再扩增，结果才准确，这使得该酶适用面窄，存在DNA检测技术操作复杂、有可能出现样本受到污染等缺陷，为提高对HBV DNA检测的广度、提高检测灵敏度、简化实验步骤，减少对标本的污染，有必要对该酶缓冲液进行改进。

【发明内容】