[发明专利]PHB1基因敲除非人动物的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种PHB1基因敲除非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括敲除PHB1基因的4号至5号外显子，使得非人动物的脉络丛组织中PHB1蛋白不表达或表达的PHB1蛋白不具有功能；

所述的构建方法包括使用sgRNA在非人动物PHB1基因的3号内含子和5号内含子各插入一个同向的特异性重组位点识别序列，获得条件性PHB1基因敲除Flox非人动物，向条件性PHB1基因敲除Flox非人动物导入重组酶或重组酶表达序列；所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO.5所示，所述的sgRNA靶向的3’端靶位点序列如SEQ ID NO.8所示；

所述的非人动物为大鼠或小鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括在非人动物PHB1基因的3号内含子和5号内含子各插入一个LoxP或Frt序列，获得条件性PHB1基因敲除Flox非人动物，将条件性PHB1基因敲除Flox非人动物与脉络丛组织中表达Cre或Flp重组酶的非人动物交配，利用Cre-LoxP或Flp-Frt基因重组系统，获得PHB1基因敲除非人动物。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的脉络丛组织中表达Cre或Flp重组酶的非人动物为将编码Cre的核苷酸序列敲入编码脉络从组织中表达的蛋白的基因中获得。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用sgRNA和/或打靶载体将LoxP或Frt序列插入PHB1基因座，其中，

所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体DNA序列，所述的供体DNA序列从5’-3’包括同向的特异性重组位点识别序列、PHB1基因核苷酸序列、同向的特异性重组位点识别序列；其中，所述的PHB1基因核苷酸序列包含PHB1基因的4号至5号外显子，所述的5’臂如SEQ IDNO.51所示，所述的3’臂如SEQ ID NO.52所示；所述的同向的特异性重组位点识别序列为LoxP或Frt。

5.一种条件性PHB1基因敲除Flox非人动物的构建方法，其特征在于，使用sgRNA在非人动物PHB1基因的3号内含子和5号内含子各插入一个同向的特异性重组位点识别序列，获得条件性PHB1基因敲除Flox非人动物，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO.5所示，所述的sgRNA靶向的3’端靶位点序列如SEQ ID NO.8所示，所述的非人动物为大鼠或小鼠。

6.一种靶向非人动物PHB1基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO.5所示，所述的sgRNA靶向的3’端靶位点序列如SEQ ID NO.8所示，所述的非人动物为大鼠或小鼠。

7.一种打靶载体，其特征在于，所述的打靶载体包含5’臂、3’臂和供体DNA序列，所述的供体DNA序列从5’-3’包括同向的特异性重组位点识别序列、PHB1基因核苷酸序列、同向的特异性重组位点识别序列；所述的PHB1基因核苷酸序列包含PHB1基因的4号至5号外显子，所述的5’臂如SEQ ID NO.51所示，所述的3’臂如SEQ ID NO.52所示，所述的同向的特异性重组位点识别序列为LoxP或Frt。

8.权利要求1-5任一所述的构建方法获得的非人动物或其后代、权利要求6所述的sgRNA或权利要求7所述的打靶载体在重金属或其他有毒物质对大脑脉络丛的毒理作用研究以及在制备治疗或预防肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症的药物中的应用。