[发明专利]PHB1基因敲除非人动物的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种PHB1基因敲除非人动物的构建方法及其在毒理学和生物医药领域的应用，利用Cre/LoxP和CRISPR/Cas9系统获得非人动物，该非人动物的脉络丛组织中PHB1蛋白不表达或表达的PHB1蛋白不具有功能，可以作为肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症药物筛选和重金属或其他有毒物质对脉络丛毒理研究的动物模型，对肥胖、糖尿病、脉络丛相关疾病、肿瘤或炎症药物研发具有重要的应用价值。

技术领域

本申请涉及基因敲除非人动物的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种PHB1基因脑敲除非人动物的构建方法及其在毒理学和生物医药领域的应用。

背景技术

脉络丛（choroid plexus, CP）是由室管膜向脑室内陷后分化而形成的，在脑室内呈网状排列，根据其解剖定位不同，可以分为侧脑室脉络丛，第三脑室脉络丛及第四脑室脉络丛三种。脉络丛不仅是脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)的重要来源，而且可以通过其活性上皮所构成的血-脑脊液屏障(blood-cerebrospinal fluid barrier, BCB)将一些血源性物质有选择地向CSF内转运，以维持CSF环境的稳态，同时也阻止了一些存在于外周循环中的有害因子对脑组织可能造成的损伤。

在外源物质的毒性作用和药理作用中，脉络丛具有双重特性，既有神经保护作用（阻隔毒物进入脑组织和脑脊液）；又是一些神经毒物的靶组织（作为毒物蓄积的部位；或外源物质毒性作用可直接导致BCB结构和功能损伤）。从神经保护的角度来看，脉络丛具有大量的微绒毛和特定功能的蛋白受体/转运体，能够有选择地主动吸收或排出一些特定的物质，可作为一些有毒重金属（如铅、汞、镉等化合物）和其它外源化合物（如药物等）的贮存场所，在脉络丛组织内屏护并浓缩这些有毒重金属和有毒物质，阻止它们进入脑脊液，保持脑脊液成分的稳定，进而对中枢神经系统起到保护作用。

脉络丛在脑的发育、成熟、老化过程、内分泌调控以及一些神经退行性疾病的发病机理中也发挥着很重要的作用。另外，对于脉络丛在脑组织炎症、老化以及继发性神经毒性机制方面的研究均有所报道。但是，国内在这些方面的研究却很有限，主要集中于脉络丛的囊肿与肿瘤等方面，对于与脉络丛相关的毒理药理研究方面未引起足够的重视，有必要进一步加强。通过系统研究BCB在内、外源性化合物作用下的反应机制、在神经性损伤及损伤后修复过程中所发挥的作用及其调控机理等，有可能发现一些神经性毒物\神经损伤的早期诊断标志物与CNS(中枢神经系统)特异性药物的转运蛋白等，推动CNS疾病诊治水平的发展。

抑制素蛋白（prohibitin，PHB1）由275个氨基酸组成，是一种结构上高度保守，广泛分布于真核生物线粒体内功能多样的蛋白。它主要参与维持线粒体结构和功能，保护细胞抵御老化，调节细胞内铁动态平衡，以及作为分子伴侣蛋白参与线粒体蛋白的稳定和线粒体结构的维持。此外，PHB1在细胞核和胞浆中的分布也使它参与到细胞周期、凋亡和转录调节等活动中，并作为细胞表面受体参与到细胞内信号转导。PHB1的表达变化直接影响着氧化应激的增加和线粒体功能障碍、结构的异常，这与某些疾病如癌症、炎性疾病、胰岛素抵抗2型糖尿病等的诱发以及慢性病的药物治疗有密切的关系。

PHB1在线粒体中的作用是目前研究最深入也是最明确的，PHB1和PHB2相互结合形成异物二聚体，每12-16个异物二聚体进一步聚合形成同心圆型地基样结构，并通过它们共有的氨基端亲脂性结构域锚定于线粒体内膜上，发挥分子伴侣蛋白作用，维持线粒体的和功能，并作为线粒体内铁储存蛋白维持体内铁动态平衡以及参与抗凋亡作用。

近年来，人们通过免疫组织化学法和免疫共沉淀等技术发现PHB1在乳腺癌细胞系和前列腺细胞系与E2F转录因子家族成员、Rb蛋白家族成员、p53肿瘤抑制蛋白等其他肿瘤生长抑制蛋白共定位于细胞核，并且通过与它们各自的交互作用发挥细胞增殖抑制和促凋亡作用。这也是PHB1渐渐被人们做为抗肿瘤药物研究的靶蛋白而受到重视的原因。