[发明专利]雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用

权利要求书

1.一种体外制备功能性精子的方法，其特征在于，所述方法包括：以雌性生殖干细胞为出发细胞，将之与睾丸体细胞混合，进行预培养以及诱导分化；从诱导分化产物中生成功能性精子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预培养包括：将雌性生殖干细胞与睾丸体细胞以1:10～10:1，较佳地1:5～5:1，更佳地1:2～2:1的比例混合，在细胞培养基中进行培养；较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基；较佳地所述细胞培养基包括DMEM培养基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括：

第1阶段诱导：以Knockout血清替代物、BMP-2、BMP-4、BMP-7、全反式维甲酸和activinA诱导；

第2阶段诱导：以Knockout血清替代物、睾酮、FSH和垂体提取物诱导。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，第1阶段中，各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％(v/v)、BMP-2 20±5ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40ng/mL；

第2阶段中，各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％，睾酮10±3mM、FSH 200±30ng/mL和垂体提取物50±15mg/mL；

较佳地，各个组分被添加于细胞培养基中；更佳地，所述细胞培养基为MEMα培养基。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的从诱导分化产物中生成功能性精子包括：观测诱导分化产物，从中分离末端携带尾部结构的功能性精子。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雌性生殖干细胞包括如下方法培养：将雌性生殖干细胞置于胚胎成纤维细胞饲养层，在含有丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、神经胶质细胞生长因子、白血病抑制因子的细胞培养基中培养；较佳地，所述细胞培养基包括MEMα培养基；较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基；

较佳地，各个组分的用量包括：1±0.3mM丙酮酸钠、2±0.6mM L-谷氨酰胺、50±15μMβ-巯基乙醇、1±0.3mM非必需氨基酸，20±5ng/mL表皮生长因子，10±3ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子，10±3ng/mL神经胶质细胞生长因子，10±3ng/mL白血病抑制因子；

较佳地，各个组分被添加于细胞培养基中；更佳地，所述细胞培养基为MEMα培养基；更佳地，所述的细胞培养基为含血清培养基。

7.一种雌性生殖干细胞诱导与睾丸体细胞混合诱导培养的产物或由其产生的功能性精子，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得；较佳地，其具有选自下组的特征：

所述的功能性精子末端携带尾部结构；

诱导体系中雄性生殖细胞减数分裂标志物呈现阳性：STRA8，SCP1，SCP2，SCP3；

精子形成标志物呈现阳性；较佳地所述标志物包括：PRM1，ACROSIN，TNP1，HAPRIN和/或ACROSIN；

所述的功能性精子为单倍体核型；和/或

注射至卵胞浆中后，所述的功能性精子启动发育，移植活体子宫能生产子代。

8.雌性生殖干细胞和睾丸体细胞的应用，用于体外制备功能性精子。

9.一种制备动物子代的方法，其特征在于，包括：

(1)以权利要求1～6任一所述的方法制备功能性精子；

(2)将(1)的功能性精子引入到卵细胞胞浆内，使卵子受精，体外发育；较佳地，在体外发育至适当阶段移植至子宫、着床、发育为健康后代。

10.一种用于体外制备功能性精子的试剂盒，其特征在于，其中包括：

雌性生殖干细胞；

睾丸体细胞；

预培养剂，包括细胞培养基；较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基；较佳地所述细胞培养基包括DMEM培养基；

第1阶段诱导剂，包括Knockout血清替代物、BMP-2、BMP-4、BMP-7、视黄酸和activin A；较佳地各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％(v/v)BMP-2 20±5ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5ng/mL、视黄酸1±0.4μM和activin A 100±40ng/mL；

第2阶段诱导剂，包括Knockout血清替代物、睾酮、FSH和垂体提取物；较佳地各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％，睾酮10mM、FSH200ng/mL和垂体提取物50mg/mL；

较佳地，诱导剂的各个组分被添加于细胞培养基中。