[发明专利]雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用

说明书

本发明提供了一种雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用。本发明首次提出体外诱导雌性生殖干细胞分化成单倍体精子细胞。该方法可为动物繁殖如优质奶牛的育种提供一种新策略。

技术领域

本发明属于辅助生殖技术领域，更具体地，本发明涉及雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用。

背景技术

国际卫生组织规定，男性的精子每毫升不低于2千万，如果低于2千万就归为少精症。少精症的病因较多，包括内源性因素如精索静脉曲张、隐睾、生殖道感染、自身免疫产生抗精子抗体。一些外源性因素也会引起少精症。目前也有一些为病因不明的特发性少精症。少精症导致男性不育，越来越多人受此困扰，生育方面有很大影响。因此，人工诱导体外产生精子，是少精症治疗的一个可行性方案。

干细胞是一类具有自我更新及多向分化潜能的细胞群体的总称。按干细胞的分化潜能的大小可以分为全能干细胞，多能干细胞和单能干细胞。胚胎干细胞(Embryonic Stemcell，ES/ESC细胞)是一种从早期胚胎或者原始性腺中分离出来的细胞，可以向多种组织进行分化，同时在体外还具有无限增殖的能力。胚胎干细胞作为一种未分化细胞，具有全能性，也就是发育为各种不同细胞的特性。其中人类的胚胎干细胞可以分化为多种细胞组织，包括滋养层细胞、神经细胞、神经胶质细胞、造血细胞、心肌细胞等。从形态上来讲，胚胎干细胞的细胞核较大而细胞质较少，且细胞结构比较简单，其中胚胎干细胞的细胞核中大多为常染色质。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。然而，由胚胎干细胞分化获得长形精子细胞存在技术难度，难以获得高活性、带有完整的尾部结构的长形精子细胞。

雌性生殖干细胞是从动物卵巢内分离获得的一类干细胞。以往科学家一直认定，雌性哺乳动物一出生，卵母细胞就停止产生，从此只会不断减少；而本发明人此前的工作中，在成年哺乳动物的卵巢中发现了雌性生殖干细胞，可以不断分化出卵母细胞。

然而，雌性生殖干细胞能否在体外发育为功能性精子细胞及其体外发育特征尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种雌性生殖干细胞转分化至功能精子的方法及应用

在本发明的第一方面，提供一种体外制备功能性精子的方法，包括：以雌性生殖干细胞为出发细胞，将之与睾丸体细胞混合，进行预培养以及诱导分化；从诱导分化产物中生成功能性精子。

在一个或多个实施方式中，所述预培养包括：将雌性生殖干细胞与睾丸体细胞以1:10～10:1，较佳地1:5～5:1，更佳地1:2～2:1的比例混合，在细胞培养基中进行培养；较佳地所述细胞培养基为含血清的培养基；较佳地所述细胞培养基包括DMEM培养基。

在一个或多个实施方式中，用于混合培养的培养基为液体培养基(培养液)。

在一个或多个实施方式中，用于混合培养的培养基中含有5％～15％胎牛血清。

在一个或多个实施方式中，所述雌性生殖干细胞与睾丸体细胞诱导分化包括：第1阶段诱导：以Knockout血清替代物、BMP-2、BMP-4、BMP-7、全反式维甲酸和activin A诱导；第2阶段诱导：以Knockout血清替代物、睾酮、FSH和垂体提取物诱导。

在一个或多个实施方式中，第1阶段中，各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％(v/v)、BMP-2 20±5ng/mL、BMP-4 20±5ng/mL、BMP-7 20±5ng/mL、全反式维甲酸1±0.4μM和activin A 100±40ng/mL。

在一个或多个实施方式中，第2阶段中，各组分用量包括：Knockout血清替代物20±4％，睾酮10±3mM、FSH 200±30ng/mL和垂体提取物50±15mg/mL。

在一个或多个实施方式中，各个组分被添加于细胞培养基中；更佳地，所述细胞培养基为MEMα培养基。