[发明专利]一种高产纤维二糖酶菌株及其构建方法与应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种高产纤维二糖酶菌株及其构建方法与应用。将启动子PpgdA基因和纤维二糖酶编码基因CB构成一个表达元件整合到PGPD‑hph载体上；将启动子PpgdA基因、hph潮霉素基因及CB基因组合元件整合到pPK2载体上；利用根癌农杆菌介导里氏木霉转化并获得高产纤维二糖酶的里氏木霉工程菌株，即所述高产纤维二糖酶菌株。与现有技术相比，本发明将纤维二糖酶基因整合到里氏木霉中，大幅提高了里氏木霉中纤维二糖酶活力，改善了里氏木霉的纤维素酶系，从而使可再生资源的酶法糖化得到长足的进展。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种高产纤维二糖酶菌株及其构建方法与应用。

背景技术

纤维质原料中纤维素、半纤维素、木质素分别占30-40％、15-30％、10-20％。纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是地球上最为丰富的可再生性天然资源。据估计，地球上纤维素中所蕴藏的能量大约相当于6400亿吨的石油所含的能量，而且纤维素的可再生性是石油等矿质能源所不可比拟的。纤维素乙醇作为一个极具发展潜力的产业，越来越受到国内外的关注和重视。纤维素乙醇的生产过程主要有原料预处理、水解、发酵及蒸馏。其中，充分利用纤维素酶对纤维素进行水解，有可能从根本上解决人类所面临的能源与粮食问题，其深远影响是不可低估的。

纤维素酶是一种多组分的复合酶，包括内切型葡聚糖酶(EC3.2.1.4，也称Cx酶、CMC酶)、外切型葡聚糖酶(EC3.2.1.91，也称C1酶、微晶纤维素酶)和纤维二糖酶(EC3.2.21,也称β-葡萄糖苷酶)等3种主要组分[Henrissat et al.，1989；Beguin，1990]。有关纤维素的酶水解机理至今仍未完全研究清楚，但普遍认为：天然纤维素水解成葡萄糖的过程须依靠这三种主要组分的协同作用才能完成。纤维素大分子首先在C1酶和Cx酶作用下逐步降解成纤维二糖，而纤维二糖酶则进一步将纤维二糖水解成2个葡萄糖(李宪臻，1996)。

目前应用最广、研究最为深入的纤维素酶生产菌种大多是里氏木霉Trichodermareesei的优良突变株。这些菌株能产生高活力的内切型及外切型β-葡聚糖酶，但其纤维二糖酶的含量和活力很低(李宪臻,1996；Himmel,1996)。因此，在利用T.reesei的纤维素酶水解纤维素的过程中，常常由于纤维二糖酶的不足造成纤维二糖的积累，而纤维二糖又会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制(Holtzapple et al,1990)。

因此，增强纤维二糖酶活力是提高纤维素酶水解得率和葡萄糖产量的关键措施之一。有研究表明在纤维素酶的反应体系中补加纤维二糖酶或利用固定化纤维二糖酶的协同作用可以明显提高纤维素的糖化效率。然而如何得到高产纤维二糖酶的菌株却是一个难点。

中国专利CN102994399B公开了一株高产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉优势菌株及其应用，具体为黑曲霉Aspergillus nigerC112，于2012年4月23日保藏于《中国典型保藏物中心》，其保藏号为CCTCCNO:M 2012129。该发明的黑曲霉Aspergillus nigerC112为紫外诱变后，经初筛、复筛后，获得的遗传稳定的突变菌株。通过适当延长黑曲霉AspergillusnigerC112种子培养时间，以麸皮、酵母粉等为原料，经液态发酵，可使β-葡萄糖苷酶酶活达到10IU/mL以上。

中国专利CN113403207B公开了一株高产β-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株及应用。本发明提供的黑曲霉菌株的保藏号为：CGMCC No.22465，是通过发酵法生产的β-葡萄糖苷酶活力高达88IU/mL，通过与里氏木霉纤维素酶制剂简单复配后形成复合纤维素酶制剂，复合纤维素酶制剂酶系更加平衡，生物质高固酶解条件下，葡萄糖释放量均提高35％以上，生物质材料中纤维素转化率90％以上，并在秸秆单细胞蛋白中完成应用，实现秸秆单细胞蛋白产品中蛋白含量25％。

以上两个专利分别介绍了不同的高产β-葡萄糖苷酶黑曲霉菌株。

发明内容