[发明专利]一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用

说明书

本发明适用于外泌体富集领域，公开了一种基于两亲性超分子磁性微球的外泌体富集方法，该方法基于四氧化三铁磁性微球进行修饰，在其表面包硅后修饰两亲性树枝状超分子复合物来捕获外泌体，利用磁性微球的磁响应性以及超分子对外泌体脂质膜的多价协同作用提升了外泌体的捕获效率，磁性微球富集到的外泌体裂解之后检测其内容物。其特征在于磁性微球表面修饰两亲性分子以及树枝状聚合物，其中两亲性分子与树枝状聚合物协同作用于外泌体的脂质膜；所述微球内核为磁性四氧化三铁纳米粒子，能够在外加磁场的作用下迅速分离富集外泌体。这种基于两亲性超分子修饰磁性微球的外泌体富集方法具有特异性强、简易高效、安全环保、可重复性高等优点。

技术领域

本发明属于外泌体富集领域，尤其涉及一种外泌体富集磁珠材料的制备方法与应用。

背景技术

外泌体(Exosome)是具有脂质双分子层膜结构的一种细胞外囊泡，直径范围为40～160nm。外泌体广泛存在于体液中并且运载着来自于不同细胞的蛋白质、DNA、RNA、脂质、小分子代谢物和表面蛋白等，这些内容物可以反映来源细胞的特征。在哺乳动物的繁殖与发育、免疫系统的调节与感染、代谢和心血管病、神经退行性疾病以及各种癌症的发展中起到重要作用，由于在病理状态下外泌体内含物的表达与正常状态具有差异，这使外泌体可以用作疾病诊断的标志物，建立对外泌体具有高选择性的分离策略具有很大的意义。

相对于目前对于肿瘤类疾病常用的组织病理切片检查而言，基于血液，尿液，唾液等常见体液的液体活检方式不仅患者的接受度更高，而且更加易于收集和进行病情监测，外泌体也有可能被用作治疗包括癌症在内的疾病的药物输送囊泡。基于外泌体的液体活检突出了其在诊断和确定患有癌症及其他疾病的患者的预后中的潜在效用，疾病进展和对治疗的反应也可以通过外泌体的多组分分析来确定。除其治疗潜力外，外泌体还具有帮助缓解疾病的潜力。综上所述，作为一种热门的疾病标志物，外泌体在疾病“液体活检”方面具有十分广阔的前景。

目前比较认可的外泌体分离技术包括超高速离心(UC)、尺寸排阻色谱法、聚合物沉淀法以及以免疫亲和沉淀为基础的分离方法和以人工抗体如Aptamer为出发点的技术。超速离心(UC)被认为外泌体分离的“金标准”，但是超高速的离心力不仅会造成外泌体的损失而且整个分离过程非常耗时，通量低而且需要昂贵的设备。其他的一些已经商业化的技术如：聚合物诱导沉淀、基于抗体的外膜蛋白亲和捕获、亲和过滤、尺寸排阻色谱等方法都有其自身的局限性。例如，基于聚合物的沉淀，通常导致低特异性和大量高丰度污染的非EV蛋白质被提取。基于亲和力的外泌体捕获方法确实提供了更好的特异性，但体积较小，导致总体回收率非常低，并且可能受到肿瘤异质性和靶抗原随时间变化的显著限制。

发明内容

本发明通过两亲性超分子对外泌体磷脂双层之间的多价协同作用力提供一种快速、高效的外泌体富集材料，旨在解决限制外泌体基础研究和应用研究的一个技术难点——简化外泌体的提取并提高外泌体的产量。

本发明实施例是这样实现的：

dendrimer-AMB修饰磁珠的制备包括如下步骤：

1)40mL的乙二醇作为反应溶剂，加入7.2g的无水乙酸钠，1g聚乙二醇和1.35g六水合氯化铁40℃反应30min，转移至高压釜中200℃反应16h，反应完成后，将得到的黑色沉淀物先用乙醇洗三次，再水洗三次，并在60℃的环境中干燥过夜；

2)Fe₃O₄@SiO₂分散于300mL浓度为80％乙醇中，超声30min分散材料，加入1.5mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，70℃反应20h，反应完成后将得到的黑色沉淀用乙醇洗涤三次后，60℃真空干燥；