[发明专利]一种hiPSC中外源基因残留检测用特异性DNA片段、引物、试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供了一种hiPSC中外源基因残留检测用特异性DNA片段、引物组、试剂盒和检测方法，本发明属于干细胞技术领域。本发明以诱导制备hiPSC时所用的游离型载体序列进行筛选特异性DNA序列，以筛选获得的特异性DNA序列分别设计检测引物，获得扩增效果好，而且检测灵敏高的引物对。本发明基于qPCR方法检测hiPSC中外源基因残留情况，不需要抽取基因组DNA，通过直接裂解细胞方式获得基因组，全程在5～6小时左右即可完成，适合hiPSC产品质控，更经济、更省时，对于监控临床级hiPSC的安全性、经济性、生产性更有保障。

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种hiPSC中外源基因残留检测用特异性DNA片段、引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

人多能干细胞(humanpluripotent stem cell，hPSC)，包括人胚胎干细胞(humanembryonic stem cell，hESC)和人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stemcell，hiPSC)，是一类能在体外无限增殖，且具有分化为成体几乎所有功能细胞潜能的干细胞。基于这两个特性，hPSC在针对目前尚无有效疗法的疑难杂症的治疗上有着广阔的临床应用前景。目前，随着干细胞技术的快速发展，越来越多的hPSC来源功能细胞产品已在各国获批进入临床试验。

hiPSC是通过在已分化的体细胞中表达特定的基因或特定基因产物等方式，重编程而获得的多能干细胞，不但避免了胚胎来源hESC涉及的社会伦理问题，而且来源丰富，遗传背景不受限制，有望克服细胞移植所面临的免疫配型问题。基于hiPSC的这些优势，近几年来，已有多类hiPSC衍生的功能性细胞产品进入临床应用。早期iPSC重编程使用了逆转录/慢病毒载体表达外源基因。这类载体能实现外源基因的长期稳定表达，从而获得较高的重编程效率，但会导致插入性基因突变，外源基因表达也会严重影响iPSC的功能和成瘤性。用于制备临床级功能细胞产品的hiPSC应不含外源DNA残留，所以需要优先的选择非整合型重编程系统的重编程方法。常用的非整合型hiPSC重编程系统常基于OriP/EBNA1的游离型DNA质粒载体构建得到。这个载体的两个关键的序列OriP/EBNA1来源于双链DNA疱疹病毒(Epstein-Barr virus，EBV)。全世界大约90％的成人都感染有EBV，在潜伏期，EBV以环形DNA质粒的形式游离于细胞基因组外，OriP与EBNA1是稳定维持其游离态唯二需要的病毒原件^[1]。OriP/EBNA1载体在转染细胞后，能在部分细胞中建立稳定的游离态(约5～50个质粒/细胞)，从而稳定表达外源基因以确保重编程的成功。而OriP/EBNA1载体复制与分配的缺陷使每次细胞分裂都有约5％的细胞丢失质粒，从而易于筛选出无痕iPSC^[2]。2009年，Yu等利用OriP/EBNA1载体首次获得了人无痕iPSC^[3]，与小分子的合用更是大幅度提高了这个系统的重编程效率^[4]。与其它方法相比，OriP/EBNA1载体有不少优点：能在多类细胞内建立稳定游离态，因此不受细胞种类的限制；可以用常规方法制备质粒，不需要病毒包装；只需一次转染，操作简单；建立游离态的细胞内只含少量载体，降低了基因组整合的风险；由于载体复制与分配的缺陷，以及表达EBNA1的病毒启动子在PSC中的沉默，只需常规传代培养就可以获取无痕iPSC，无需繁杂的单细胞克隆筛选工作。因此这个方法在制备临床级iPSC中比较常用。

虽然OriP/EBNA1载体可以经hiPSC多次传代后丢失，但是仍然可能存在剔除不完全，重编程质粒在hiPSC内残留的风险，从而增加细胞产品致瘤性的安全隐患。在国际及国内研究中，详见我国《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则》对外源性异物(外源基因)有严格要求。虽然制备hiPSC的方法是多样的，但是均要严格遵从外源基因的控制原则，把控产品质量标准，因此要对涉及外源基因诱导形成hiPSC细胞时，要有合适于产业化规模生产且灵敏度高的检测方法检测hiPSC细胞产品中的外源基因的残留以使产品符合临床使用及下游应用。