[发明专利]一种rhG-CSF的发酵培养基及其发酵方法

说明书

本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及rhG‑CSF的发酵培养基及发酵方法。本发明通过优化不同时期发酵温度的控制范围和发酵pH值控制范围，改变基础培养基碳源的添加时间，优化培养基配比和补料量，限制性流加补料，低浓度的IPTG与乳糖协同诱导，更有利于rhG‑CSF发酵的高密度高表达。发酵结束，发酵密度OD600值达到100以上，发酵目的蛋白表达量达到77％以上，质粒丢失率在4％以内，本发明的rhG‑CSF高密度发酵提高了生产效率，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种rhG-CSF的发酵培养基及其发酵方法。

背景技术

粒细胞集落剌激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)具有促进粒系造血 干细胞增殖分化及增强成熟粒细胞功能的作用，对于骨髓移植时促进中性白细胞增加、癌 症化疗时引起的严重中性粒细胞缺乏症、以及再生障碍性贫血伴随的中性白细胞缺乏症均 有明显疗效。其早期临床适应症为癌症化疗及骨髓移植后的中性粒细胞减少，以后逐步扩 大到各种病因引起的中性粒细胞减少症。

高密度发酵技术可以提高菌体的发酵密度，提高产物的比生产率，其不但可相应减少 发酵规模和生产批次，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，从而大大 提高产品竞争力。大肠杆菌的遗传背景研究比较透彻，加之其容易培养，生长速度快，表 达载体丰富、大规模培养工艺成熟、表达量高等特点，使其成为应用最广泛的基因工程合 成异源蛋白的原核表达系统。

然而，外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系， 而且与其所处的环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需 要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。

基因工程菌发酵问题中最重要的两个问题是菌体的高密度发酵和诱导条件的确定。菌 株的高密度生长将导致供氧不足和培养基中大量乙酸的产生，这将极大的影响菌体的生长； 另外，菌体密度的高低与外源蛋白表达量之间并没有相关性，他们之间的结合点就是诱导 条件的确定。

基因工程菌在发酵过程中重组质粒会出现一定的不稳定性，将导致得不到预期的目的 基因产物及产量。质粒的稳定性受到宿主和质粒的基因型、宿主和质粒的相互作用、基因 表达程度、培养温度、营养限制和反应器操作方式等多种遗传和环境因素的影响。基因工 程发酵通常需要高密度菌体培养，以获得更多的目的产物，然而过高的菌体密度会影响工 程菌的质粒稳定性，目前考察高密度培养过程质粒稳定性的文献并不多。

合适的诱导剂种类和浓度选择是基因工程菌成功表达的关键。异丙基-β-D-硫代半乳糖 苷(IPTG)毒性较大、成本较高，而乳糖作为二糖，无毒、价廉，本身可以作为碳源使用， 是一种较佳的IPTG替代。而IPTG较乳糖等其他乳糖类似物诱导剂相比是最高效的诱导剂， 因此选用何种诱导剂需要进行实验验证。