[发明专利]一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用

权利要求书

1.一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到。

2.权利要求1所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠，并检测血清效价，当抗体水平达到1:10000以上时，选取抗体水平最高的小鼠，脾脏注射高纯鸡IgY进行加强免疫，4d后取脾脏细胞制备待融合的脾淋巴细胞悬液；

采用小鼠腹腔培养物制备饲养层细胞板，其中小鼠腹腔培养物中细胞的浓度为1×10⁵个/mL～10×10⁵个/mL；

将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，在浓度为30～50％的PEG 1000～4000，pH为8.0～8.2的条件下融合90～150s；

之后对杂交瘤细胞进行选择培养和克隆化处理，采用间接Elisa法检测筛选即得。

3.根据权利要求2所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠的步骤如下：

第0天，采用鸡IgY抗原和FCA佐剂进行首免；

第21天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行加强免疫；

第42天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行再次加强免疫；

从尾巴或眼眶采血，收集血清并检测效价，第三次免疫15～20天后腹腔内注射纯抗原进行融合前的强化免疫。

4.根据权利要求2或3所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，小鼠免疫采用的是sigma公司佐剂。

5.根据权利要求2所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，脾淋巴细胞悬液与小鼠骨髓瘤细胞NS1的融合步骤如下：

将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，室温下离心，弃去上清液；

轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散成均匀的糊状，加入50％的PEG-3000溶液，与沉淀细胞混匀，作用时间控制在90s，同时控制pH在8.0～8.2之间；

之后加入基础培养液终止促融作用，将终止反应的细胞悬液离心，弃上清，加入HAT培养液悬浮并混匀融合后的细胞。

6.根据权利要求5所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，终止促融作用的基础培养基5min内加完。

7.根据权利要求3所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将混匀后的融合细胞加入已铺有饲养层细胞的培养板中，37℃，5％的CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，并筛选后再进行克隆化处理。

8.根据权利要求7所述的鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用有限稀释法对筛选后的阳性杂交瘤细胞进行克隆化处理。

9.权利要求1～8任一项制备得到的鼠抗鸡IgY单克隆抗体在试剂盒中的应用。