[发明专利]一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用

说明书

本发明具体涉及一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用。该单克隆抗体采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到，其作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象。本发明同时对其制备方法进行了进一步的改进，通过对其制备方法改进，可以更好的得到效价更高、抗体产量更高的单克隆抗体。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法和应用。

背景技术

IgY(immunoglobulin of yoik)是在鸟类、两栖动物和爬行动物中发现的主要免疫球蛋白。与哺乳动物IgG相比，两者均包含两条重链和两条轻链，它们由可变结构域(VH和VL)和四个恒定结构域(CH1，CH2，CH3和CH4)组成、两者均具有特征性的抗体Y形、两者都是二价的、两者都起着相似的生物学作用，是主要的免疫球蛋白，有相似的稳定性，可提供对传染源的防御作用，均在最初合成较高分子量的抗体(IgM)后高浓度出现。

这导致人们提出IgY可能是哺乳动物IgG和IgE的祖先分子，目前已在基因和结构研究中得到证实。但是，IgG和IgY又有着不同之处：IgY与哺乳动物IgG之间几乎没有免疫交叉反应；IgY由于额外的重链恒定结构域，分子量更高，据MALDL-TOF MS分子量测算，IgG分子量150kDa(轻链23kDa×2，重链50kDa×2)，而IgY分子量167kDa(轻链19kDa×2，重链65kDa×2)，SDS-PAGE法测算的IgY分子量还达180kDa左右；IgY铰链区短且不灵活，含有3对糖基，而IgG铰链区灵活，含有2对糖基；IgY重链缺少Fc结构域，因此它们不固定补体或结合蛋白A或蛋白G，所以只用抗原来纯化。

因此，鉴于这些差异和相似之处，在大多数实验应用中，包括蛋白质印迹，免疫组织化学，免疫细胞化学，ELISA和功能阻断实验，IgG和IgY都是等效的，这意味着IgY通常可用作IgG的直接替代物。

但是，现有的IgY抗体一般是羊抗鸡IgY多克隆抗体，其往往存在抗体效价低、特异性批间差异大的问题，难以满足应用要求。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体，该单克隆抗体作为标记物可以有效的解决层析实验中的HOOK现象。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

本发明提供一种鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠制备得到。

优选地，所述鼠抗鸡IgY单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠，并检测血清效价，当抗体水平达到1:10000以上时，选取抗体水平最高的小鼠，脾脏注射高纯鸡IgY进行加强免疫，4d后取脾脏细胞制备待融合的脾淋巴细胞悬液；采用小鼠腹腔培养物制备饲养层细胞板，其中小鼠腹腔培养物中细胞的浓度为1×10⁵个/mL～10×10⁵个/mL；将待融合的脾淋巴细胞悬液与复苏后的小鼠骨髓瘤细胞NS1按体积比(5～10):1混合，在浓度为30～50％的PEG 1000～4000，pH为8.0～8.2的条件下融合90～150s；之后对杂交瘤细胞进行选择培养和克隆化处理，采用间接Elisa法检测筛选即得。

优选地，采用高纯鸡IgY作为抗原免疫小鼠的步骤如下：第0天，采用鸡IgY抗原和FCA佐剂进行首免；第21天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行加强免疫；第42天，采用鸡IgY抗原和FIA佐剂进行再次加强免疫；从尾巴或眼眶采血，收集血清并检测效价，第三次免疫15～20天后腹腔内注射纯抗原进行融合前的强化免疫。

优选地，小鼠免疫采用的是sigma佐剂。