[发明专利]蛋白SaCas9的抗原表位及其在基因编辑中的应用

权利要求书

1.一种突变的Cas9蛋白，其特征在于，所述的Cas9蛋白是源自Staphylococcus aureus的SaCas9蛋白，或者所述突变的Cas9蛋白源自SEQ ID NO 1；

所述的突变的Cas9蛋白具有剪切基因的活性并且其突变选自但不限于：A144G，E146G，E147G，D161G，G162A，D270A，E271G，E273G，P294A，T295A，D309A，P321A，E322G，A337G，R338G，T369A，E378G或者含有序列如SEQ ID NO 3(200-208)所示的短肽。

2.如权利要求1所述突变的Cas9蛋白，其特征在于，所述的突变选自E271G、P321A或者R338G。

3.一种SaCas9蛋白的细胞抗原表位，其特征在于，所述的抗原表位选自A144G，E146G，E147G，D161G，G162A，D270A，E271G，E273G，P294A，T295A，D309A，P321A，E322G，A337G，R338G，T369A，E378G或者其氨基酸序列如SEQ ID NO 3(200-208)所示的所示。

4.一种核酸，其特征在于，所述的核酸是权利要求1或者2的Cas9蛋白或者权利要求3的抗原表位的编码序列。

5.一种CRISPR-Cas9系统，其特征在于，使用权利要求1或者2的Cas9蛋白替代野生型Cas9蛋白。

6.权利要求1或者2所述突变的Cas9蛋白的制备方法，按照突变的Cas9蛋白或者序列人工合成；

或者，在源自Staphylococcus aureus的SaCas9蛋白基础上通过筛选获得，包括以下步骤：

A.通过生物信息学软件辅助筛选SaCas9蛋白中具备免疫原性但不位于其基因剪切功能位点的抗原表位；

B.根据步骤A筛选到的抗原表位构建突变的SaCas9蛋白或合成肽段；

C.使用SaCas9特异抗体阳性的供体血清对突变的SaCas9蛋白进行抗原抗体反应检测并剔除假阳性位点；或者使用SaCas9特异激活T细胞阳性的供体PBMCs检测分析并剔除T细胞激活水平达不到阈值的候选表位；

D.通过基因剪切实验验证突变的SaCas9蛋白，并剔除失去基因剪切作用的SaCas9蛋白。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，

对于B细胞抗原表位，通过生物信息学软件辅助筛选SaCas9蛋白中突变后能够降低免疫原性但不影响其基因剪切功能的抗原表位包括以下步骤：

根据SaCas9蛋白的氨基酸序列和晶体结构模型预测其B细胞抗原表位，使用DISCOTOPE2.0与IEDB ELLIPRO软件基于连续表位和不连续表位对每个氨基酸残基进行突出指数评分，以PI＝0.5、残基距离作为阈值，筛选出符合要求的线性表位和构象表位，并获得第一阶段B细胞抗原表位；

对SaCas9蛋白所有氨基酸残基进行亲水性参数、表面可及性参数、抗原性参数和柔韧性参数进行综合预测分析，以亲水性参数≥0，表面可及性参数≥1，抗原性参数≥1作为筛选标准，在所有残基中得到B细胞抗原表位的优势区段，作为第二阶段B细胞抗原表位；

将第一阶段B细胞抗原表位和第二阶段B细胞抗原表位结果进行汇总，选取重合的135个氨基酸位点作为SaCas9蛋白B细胞抗原表位最终的预测结果，即第三阶段B细胞抗原表位；

根据第三阶段B细胞抗原表位，排除功能结构域上的位点后，将其在SaCas9蛋白上分别突变为甘氨酸或丙氨酸，同时构建携带指示标记的切割活性检测系统，在该检测系统上筛选获得不影响切割活性的突变的SaCas9蛋白，并将相应的17个氨基酸位点作为第四阶段B细胞抗原表位；

获得切割活性不受影响的第四阶段B细胞抗原表位单氨基酸突变的SaCas9蛋白，作为抗原检测其与SaCas9特异抗体阳性的供体血清的抗原抗体反应水平，抗原性下降大于等于50％的B细胞抗原表位作为第五阶段B细胞抗原表位。