[发明专利]蛋白SaCas9的抗原表位及其在基因编辑中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供了一种突变的Cas9蛋白，其具有剪切基因的活性并且其突变是能够降低免疫原性的抗原表位，选自A144G，E146G，E147G，D161G，G162A，R269G，D270A，E271G，N272G，E273G，P294A，T295A，D309A，P321A，E322G，A337G，R338G，T369A，E378G或短肽200‑208 TYIDLLETR。本发明还包括SaCas9蛋白的抗原表位及其在基因编辑方面的应用。本发明的优势抗原表位对SaCas9蛋白切割功能活性无影响，对Cas9蛋白的去免疫化改造能改善CRISPR‑Cas9系统可能诱发的人体免疫反应问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及SaCas9蛋白的抗原表位，包括SaCas9蛋白的突变体及其在基因编辑方面的应用。

背景技术

CRISPR-Cas9作为一种新型基因编辑工具，因其高效性和简便性而广泛应用于实验室研究中，并逐渐应用于多种人类疾病的基因治疗中。CRISPR(Clustered RegularlyInterspaced Short Palindromic Repeats)中文全称是规律间隔成簇短回文重复序列，Cas是CRISPR相关蛋白的简称，CRISPR和Cas构成CRISPR–Cas系统。CRISPR–Cas系统中，Cas9能够靶向地切除在细菌内的外源DNA，而不会切除自身DNA。CRISPR技术依靠一种利用引导性RNA分子将其导向目标DNA、Cas9按照预定方式编辑DNA，可以纠正导致疾病的基因错误，消除导致疾病的微生物，治疗复杂疾病，培育更健康的新型食物，根除地球最危险的害虫乃至复活珍惜物种。

Cas9蛋白作为介导CRISPR-Cas9系统行使功能的重要组成部分，已有多种同源蛋白被发现并应用。其中Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)因其较小的分子量、较高的基因编辑效率和较低的脱靶风险，尤其易于被重组腺相关病毒(AAV)载体包装，而将成为临床基因治疗的有力工具。

然而，在这项技术应用于临床基因治疗的过程中，除了需要避免SaCas9潜在的脱靶效应外，也要克服人体可能产生的针对SaCas9蛋白的免疫反应。研究发现人体预先存在着Cas9蛋白特异的免疫反应，包括先天免疫和适应性免疫，这些免疫反应的存在可能会使治疗效果降低，安全性风险提高。历史上，基因治疗曾因为一位患者因载体引发系统性炎症致死而陷入停滞。宾大Carl.H.June团队发现，Ex vivo基因治疗I期临床检测到患者Cas9蛋白的免疫原性极低。但是与ex vivo不同，in vivo途径或者表观遗传疗法需要体内长期表达Cas9，例如，使用AAV递送CRISPR-Cas9系统到小鼠肝脏，会导致CD8+T细胞在肝脏聚集、导致肝损伤，这表明免疫原性为题将会成为CRISPR-Cas9临床应用的巨大障碍。

因此，利用蛋白质工程手段改造SaCas9蛋白，获得功能活性不受影响的低免疫原性突变体，可以有效地解决Cas9蛋白诱发的人体免疫反应问题，进而提高CRISPR-Cas9靶向基因治疗的安全性和有效性，加快基因编辑技术向临床转化的进程。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在不改变Cas9蛋白基因剪切活性的前提下降低其免疫原性，从而提高CRISPR-Cas9在基因治疗临床应用中的安全性和有效性。