[发明专利]一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法

权利要求书

1.一种病毒和/或其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：

(1)预引物；

(2)转录模板；

(3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；

(4)Cas13蛋白；

(5)体外转录试剂；

(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；

(7)去磷酸化试剂；

所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：

所述转录模板序列为一段DNA，由从5’端至3’端依次连接的适配体互补序列、T7启动子互补序列、间隔序列和引物前锚序列构成；

所述预引物序列由从5’端至3’端依次连接的成熟引物序列、切割识别序列和末端序列构成；

所述成熟引物序列为至少有15个碱基的DNA序列，且与所述引物前锚序列反向互补；

所述切割识别序列为UU与AU或AA与UA；所述间隔序列的最后一位碱基与切割识别序列的第一位碱基互补，间隔序列的倒数第二位碱基与切割识别序列的第二位碱基不互补；

所述末端序列为随机DNA碱基序列，且不与转录模板序列互补；

所述crRNA为一段RNA，序列包括2部分：1)向导序列：负责与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物进行互补配对，形成双链；2)锚定序列：位于向导序列的5’端，依赖其二级结构，可结合Cas13蛋白；

所述Cas13蛋白为Lwacas13a或Lbucas13a；

所述ssRNA体外扩增用引物分为正向引物和反向引物，正向引物的5’端添加有T7启动子序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA与Cas 13a结合后形成Cas 13a-crRNA复合物，Cas 13a-crRNA复合物中，crRNA的向导序列与病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增产物形成双链，构成Cas13a-crRNA/ssRNA复合物的情况下激活Cas13蛋白的反式酶切活性；

所述预引物经Cas13a-crRNA/ssRNA复合物在切割识别序列处切割后，经去磷酸化试剂去磷酸化从而释放出成熟引物，成熟引物与转录模板的引物前锚序列杂交，形成转录扩增起始复合物；

所述转录扩增起始复合物经体外转录试剂生成发光RNA适配体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述切割识别序列为UU，Cas13蛋白为Lwacas13a。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述体外转录试剂包括T7 RNA聚合酶，所述去磷酸化试剂包括T4多聚核苷酸激酶。

5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括无外切酶活性的Klenow片段。

6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述病毒为新冠病毒；所述病毒的突变体是新冠病毒S基因发生N501Y突变形成的突变体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，

所述预引物序列如SEQ ID NO.1所示；

所述转录模板序列如SEQ ID NO.2所示；

所述靶向病毒的crRNA的序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；

所述病毒的ssRNA体外扩增用引物序列的正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示，或，正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ IDNO.8所示；

所述靶向病毒突变体的crRNA的序列如SEQ ID NO.9所示；

所述病毒突变体的体外扩增用引物的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。

8.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，

所述生成的发光RNA适配体可以特异性结合核酸染料，并使染料荧光增强。