[发明专利]一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种无标记和等温检测病毒及其突变体的试剂盒，其特征在于，包括如下部分：(1)含切割识别序列的预引物；(2)从5’端至3’端由适配体互补序列(L‑broccoli)、T7启动子互补序列(L‑T7启动子)、间隔序列和引物前锚序列依次连接构成的转录模板。(3)crRNA或其DNA模板；(4)Cas13蛋白(5)体外转录试剂；(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；(7)去磷酸化试剂。本发明的试剂盒对新冠病毒及变体检测的灵敏度、特异性高、检测限为0.216fM，操作步骤简单，有望用于临床相关RNA病毒检测，应用前景良好。

技术领域

本发明属于病毒检测领域。具体涉及一种检测病毒及其突变体的试剂盒和方法。

背景技术

全球流行病学数据表明，随着新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的病原体新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的传播，毒株的变异也随之产生，并导致更高的传播率和更强的免疫逃逸反应。例如新冠病毒刺突蛋白(S蛋白)中的错义突变(N501Y)能使SARS-CoV-2病毒的传播速度增加70％。突变毒株的出现给新型冠状病毒的检测提出了新的要求。快速开发高效，准确的突变检测方法，势必成为应对病毒突变，有效控制传播的关键。然而，现有的新型冠状病毒检测方法，包括核酸分子识别和血清免疫检测都无法准确检出突变。因此，亟需构建快速、低成本和高通量变异新冠病毒检测和筛查试剂盒。

CRISPR-Cas(聚簇的规则间隔的短回文重复序列)是一类特殊的核酸蛋白复合体，一般具有RNA降解酶(RNase)或DNA降解酶(DNase)的活性，使得 CRISPR/Cas系统成为下一代诊断平台的完美候选物。其中，CRISPR/Cas13a 是唯一以RNA为靶点的CRISPR效应体，具有超强的信号放大能力。 CRISPR-Cas13a系统由一个Cas13a蛋白和一个crRNA组成。靶RNA被crRNA 特异性识别并激活Cas13a的RNA酶活性，对所处环境中的其它RNA分子进行非特异性的切割，被称作“旁切割”(collateral cleavage)。CRISPR-Cas13a系统在SARS-CoV-2病毒诊断中具有广阔的应用前景。取消昂贵的探针(如淬灭剂和荧光基团修饰的RNA探针)和昂贵的仪器(如热循环仪)，预计将促进其在资源有限地区的SARS-CoV-2病毒常规检测中的使用。

目前，利用CRISPR/Cas系统进行病毒检测的试剂、方法的报道较少，进一步开发高效、准确的基于CRISPR/Cas系统的病毒检测试剂，丰富病毒核酸检测和筛查的手段，仍具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种无标记和等温检测新冠病毒和/或其突变体的试剂盒。

本发明提供了一种病毒和/或其突变体的试剂盒，包括如下部分：

(1)预引物；

(2)转录模板；

(3)靶向病毒和/或其突变体的crRNA或其DNA模板；

(4)Cas13蛋白；

(5)体外转录试剂；

(6)病毒和/或其突变体的ssRNA体外扩增用引物；

(7)去磷酸化试剂；

所述预引物、转录模板的序列满足如下条件：

所述转录模板序列为一段DNA，由从5’端至3’端依次连接的适配体互补序列、T7启动子互补序列、间隔序列和引物前锚序列构成；

所述预引物序列由从5’端至3’端依次连接的成熟引物序列、切割识别序列和末端序列构成；

所述成熟引物序列为至少有15个碱基的DNA序列，且与所述引物前锚序列反向互补；