[发明专利]一种外泌体PD-L1糖基化检测方法

说明书

本发明公开了一种外泌体PD‑L1糖基化检测方法，包括如下步骤：1)用PD‑L1适体即序列PDL1‑S‑T1，标记外泌体PD‑L1；2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO‑S‑T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1‑S‑T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO‑S‑T2的至少一段互补的序列；4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1‑S‑T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO‑S‑T2的至少一段互补的序列；5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD‑L1糖基化信息。

技术领域

本发明涉及一种外泌体PD-L1糖基化检测方法。

背景技术

外泌体上糖蛋白在跨膜信号传递、免疫抑制、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要的调节作用，外泌体特定蛋白的糖基化检测有助于理解其在生理病理过程中的作用。

目前外泌体蛋白糖基化的检测方法主要包括质谱(MS)、液相色谱(LC)和凝集素微阵列(LMA)等。但这些方法存在检测效率低，样品前处理过程复杂，无法研究完整外泌体等不足，因此难以实现生理状态下的外泌体蛋白糖基化水平灵敏分析。最近发展的代谢聚糖标记(MGL)策略通过在细胞培养基中加入非天然单糖和后续的化学偶联将功能性化学基团移植到细胞膜聚糖中，该方法保持细胞的完整性，不明显影响其生物学功能。然而MGL策略没有选择性，为了实现特定蛋白糖基化的选择性标记，需结合特定蛋白的识别手段，例如通过绿色荧光蛋白(GFP)或者靶标特异性适配体标记目标蛋白，结合MGL标记的特定功能化学基团，然后通过荧光共振能量转移(FRET)实现特定蛋白糖基化成像。然而FRET技术的检测灵敏度较低，不适用于低丰度的外泌体糖蛋白检测，及示踪糖基化的细微变化。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种外泌体PD-L1糖基化检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种外泌体PD-L1糖基化检测方法，包括如下步骤：

1)用PD-L1适体即序列PDL1-S-T1，标记外泌体PD-L1；

2)通过修饰环炔基DBCO的DNA即序列DBCO-S-T2，与代谢标记的外泌体表面糖上叠氮的无铜环加成反应标记外泌体的糖；

3)加入DNA连接臂，所述的连接臂分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段互补的序列；

4)加入探针H1和H2，其中，所述的探针H1和探针H2互补，且其中一探针分别具有和序列PDL1-S-T1的至少一段互补的序列以及和序列DBCO-S-T2的至少一段互补的序列；

5)扩增，检测扩增信号，得到外泌体PD-L1糖基化信息。

优选地，序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列，和序列PDL1-S-T1上与连接臂互补的序列不重叠；序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列，和序列DBCO-S-T2上与连接臂互补的序列不重叠。

优选地，步骤3)中，所述的连接臂长度优选为20个-80个碱基。

优选地，序列PDL1-S-T1上和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。

优选地，序列DBCO-S-T2上和连接臂互补的片段优选位于中间10-20个碱基。

优选地，序列PDL1-S-T1上与探针H1或H2互补的序列位于序列PDL1-S-T1的末端10-20个碱基，序列DBCO-S-T2上与探针H1或H2互补的序列位于序列DBCO-S-T2的末端5-15个碱基。