[发明专利]ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用

说明书

本发明公开了ppc突变体及其在制备L‑缬氨酸中的应用。本发明公开的ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为精氨酸得到的蛋白质。本发明首先通过对ppc基因进行单点突变得到ppc^G556C基因，然后构建过表达ppc基因或ppc^G556C基因的重组菌以及ppc基因敲除的重组菌，最后通过对构建的重组菌进行发酵培养发现，ppc基因或ppc^G556C基因可以调控细菌L‑缬氨酸产量。本发明首次发现ppc基因参与L‑缬氨酸的生物合成，对于培育符合工业化生产的高产、高质量菌种，以及缬氨酸工业化生产具有重大的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ppc突变体及其在制备L-缬氨酸中的应用。

背景技术

L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为α-氨基异戊酸，是支链氨基酸之一，人和动物自身不能合成。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，具有促进蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增强机体的免疫防护作用，有助于纠正因手术、创伤、感染等引起的负氮平衡。另外，L-缬氨酸还具有抗中枢疲劳、抗外周疲劳、延缓运动性疲劳和加快运动后机体修复的作用，因此在食品和医药行业具有广泛的应用及商业价值。由L-缬氨酸配制的复合支链氨基酸输液在血脑屏障、肝昏迷、慢性肝硬化以及肾功能衰竭的治疗，先天性代谢缺陷病的膳食治疗，败血症及术后糖尿病患者的治疗，加快外科创伤愈合的治疗和肿瘤患者的营养支持治疗中应用广泛。L-缬氨酸在食品工业上主要用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等。L-缬氨酸凝胶具有带正电的端基，是新型低分子量凝胶，不仅可以使纯化和含有无机酸和盐的水溶液成凝胶而且可以使有机溶剂和油成胶状，可以制备形成水凝胶，其在生物医药、组织工程、光化学、电化学、食品工业、化妆品等领域已被广泛应用。L-缬氨酸因其含有特殊的生理功能，市场需求量大，使得L-缬氨酸的生产备受关注。

目前，L-缬氨酸大都采用直接发酵法生产，工业发酵中获得高产的菌种，对于L-缬氨酸的发酵生产来说是至关重要的，是整个L-缬氨酸发酵工业的核心，是决定发酵产品工业价值的重要因素。随着L-缬氨酸的市场需求不断增加，选育高产、稳定的生产菌种，促进L-缬氨酸在微生物体内的积累，进一步提高L-缬氨酸的产量一直是L-缬氨酸发酵工业技术开发和发酵工程化研究的热点，并且也将一直伴随L-缬氨酸发酵工业的发展，对于促进L-缬氨酸产业化的进程具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是如何利用ppc基因构建产缬氨酸工程菌，以进一步提高缬氨酸产量。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种ppc突变体。

本发明提供的ppc突变体是将ppc蛋白质第186位氨基酸残基由甘氨酸突变为其他氨基酸残基得到的蛋白质；

所述ppc蛋白质为如下A1)-A3)中的任一种：

A1)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)将A1)所示的氨基酸序列经过除第186位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与细菌产缬氨酸相关的蛋白质；

A3)来源于细菌且与A1)或A2)具有95％以上同一性且与细菌产缬氨酸相关的蛋白质。

上述A2)所述的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述A3)所述的蛋白质中，这里使用的术语“同一性”指与天然氨基酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的氨基酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。