[发明专利]一种基于高通量测序技术的芽孢杆菌种水平鉴别方法

说明书

本发明公开了一种基于高通量测序技术的芽孢杆菌种水平鉴别方法，属于分子生物学技术领域。本发明所提供的方法可以检测到复杂样品中85种芽孢杆菌的鉴别，检测准确率达到100％。并且可实现高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的芽孢杆菌组成，并且可以鉴定至种水平，分辨能力高于现有方法，同时扩增的长度符合二代测序的要求，能够显著节省时间和鉴定成本。本发明的方法具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序技术的芽孢杆菌种水平鉴别方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

芽孢杆菌能够在大多数自然环境中生存，常常造成食品在获取、加工、处理过程中的污染。常见的种主要包括地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。芽孢杆菌具有一层厚的肽聚糖层，提升了对温度、湿度等环境的适应能力；能够在属内或属间形成生物膜以增强其耐药性并大量增殖；通过形成孢子，耐受热加工等常规的杀菌手段。在所有的食品微生物污染中，最难以消除，并造成持续性的影响，导致产品质量的下降和企业的损失。另外，部分种如苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等还能产生肠毒素，造成诸如腹泻、呕吐等食源性疾病。

在生鲜乳中，芽孢杆菌造成的污染也时有发生，作为革兰氏阳性菌中的主要嗜冷菌成员，成为低温储存过程中的优势菌。同时其产生的孢子能够在巴氏杀菌、超高温瞬时灭菌后存活萌发。代谢水解酶是其直接损害手段，该属具有广泛而在种间有差异的蛋白、脂肪水解能力。有研究白表明，其污染能够缩短25％的储存时间。并且其酶活受储存温度、种类影响明显。现有的手段对芽孢杆菌感染显得力不从心，基于对食品工厂实际情况的考量，为防止受污染的原料引入造成更大批量的污染，对芽孢杆菌的快速预前成为防控其造成污染的主流思路。

芽孢杆菌对于营养条件的要求不高，因此基于培养的平板菌落计数手段能够很好的评价样品中的芽孢杆菌的数量，但基于培养的方法并不能满足样品检测通量、速度、时效性、灵敏度的要求，同时基于表型进行菌种鉴别，准确性也非常低。除此之外，还有对于芽孢所产毒素进行标记物检测的，这种检测虽然准确可靠，但无法实现预警。随着分子生物学的发展，更多分子手段的检测方法被用于该属的检测。有研究者通过一种定量实时PCR来评估牛奶中的孢子浓度，但该方法检测限不够，需要进行二氧化硅磁珠的富集操作，并且这种检测手段存在种间差异性，对蜡状芽孢杆菌的检测极限到达10³CFU/mL，但对其他孢子形成菌检测能力则达不到该数量级。另一种等温环介导扩增技术(LAMP)能够实现在60分钟内孢子形成菌的识别，但其检测限和特异性过强仅可对吧少数种进行鉴别。有研究者通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)的方法采用生物标记物的方法进行孢子形成芽孢杆菌的鉴定，这种方法检测准确性高，但检测成本和通量无法满足要求。

因为芽孢杆菌的广泛危害，过往也有不少对于芽孢杆菌的专利研究。国外的研究中，一项生物试纸条的方法，利用芽孢特异性适配的聚二乙炔脂质体对样品中产芽孢杆菌进行属水平鉴别(KR1020200119737A)。一项韩国的研究，通过MLSA的方法串联4个扩增序列，实现蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌的准确检测，这种检测方法虽然能够满足检测限、准确度、灵敏度的要求，但基于MLSA在菌株快速鉴别中分析繁琐、效率低等缺点不能满足快速检测的需要，且仅能够对两个种进行鉴别限制了检测范围(KR1020120131784A)。另外一项研究则能够将枯草芽孢杆菌及其亚种筛选出来(KR1020170145878)。一项印度的专利使用核糖体DNA限制性分析(ARDA)发现蜡状芽孢杆菌与其他种间存在一条切割位点的差异，从而将其从属内鉴别出来(IN2656DEL2008A)。法国一项研究通过检测以PC-PLC为底物的水解反应时间和ph的变化来识别食品中的蜡样芽孢杆菌(FR2950363B1)。