[发明专利]一种猴ips细胞系DT-M001建立及其应用

权利要求书

1.一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离恒河猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；使用添加了组蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；观察和鉴定诱导性猴多能干细胞克隆。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，进一歩包括将报告基因导入猴耳源成纤维细胞，以此报告基因来指示所述诱导性猴多能干细胞的形成及其形成效率。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述报告基因为Oct4-GFP或Nanog-GFP,且优选为Oct4-GFP。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子选自Oct4、Sox2、Soxl、Klf4、Klf2、Klf5、Nanog,c-Myc、L-Myc、N-Myc、Lin28和Esrrb中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，在歩骤1中，所述干细胞多能性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，或者包括Oct4、Sox2和Klf4。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述组蛋白脱乙酰酶抑制剂包括丙戊酸钠、丁酸钠和ALK4/5/7抑制剂等。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中，所述丁酸钠的工作浓度为0.1-0.25μM，丙戊酸钠选为5-10μM，ALK4/5/7抑制剂为5-10μM。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，在歩骤2中所述培养基为mES培养基和MX培养液，所述mES培养基为添加有15％胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和β-巯基乙醇的DMEM,且所述MX培养基为添加有38％KO-DMEM、24％DMEM/F12、10％KOSR、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素和3.9mg/Lβ-巯基乙醇、0.145g/L L-谷氨酰胺、0.5％B27、0.25g/L牛血清白蛋白、和8μg/L碱性成纤维生长因子配制而成。

9.根据权利要求1所述的方法，在步骤2中，所述饲养层细胞准备方法。取怀孕12.5天的母鼠，分离小鼠胚胎，去除胚胎四肢、内脏和头部，将余下部分剪碎经胰酶消化成单个细胞后接种于培养后，经75Gyγ射线照射获得照射过的小鼠胚胎成纤维细胞(irradiatedmouse embryonic fibroblasts，iMEF)；着用10ug/ml的丝裂霉素C处理2-3小时，即获得饲养层细胞，液氮冻存。实验前1天复苏，接种至孔板或培养皿中备用。

10.据权利要求1所述的方法，在步骤2中，iMEF传代前，为接种了iMEF细胞的培养皿更换cmiPS培养液，在培养箱中预热至37℃。

11.据权利要求1所述的方法，在步骤2中，机械传代法：克隆生长至可传代时，PBS洗一次，更换培养液，在体视显微镜下用10μl的枪头将克隆划为约含5～10个细胞的小团块，用吸管将细胞团块转移并接种于含iMEF的六孔板内，后置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养。于24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次；0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化传代法：克隆生长至可传代时，吸去旧培养液，PBS洗两次，37℃下加入0.5mM EDTA或者胶原酶Ⅳ消化3～5min。镜下观察克隆中细胞变圆，边缘卷起时，吸走消化液，加入培养液终止消化，用1ml的移液器轻缓反复吹打至小团块状，使细胞充分脱壁。收集细胞悬液，1100rpm离心4min，调整细胞密度后接种于新的iMEF细胞的六孔板内，置于培养箱中继续培养。24h更换培养液，每天换液，6～8天传代一次。