[发明专利]一种猴ips细胞系DT-M001建立及其应用

说明书

本发明公开了一种能快速有效的将猴体细胞诱导重编程为多能性干细胞(induced Pluripotent stem cell,iPS)的制备系统。利用该培养系统，可以在短期内高效快速的制备猴iPS细胞。该系统的特征是所用体细胞来自猴体细胞，在猴耳源成纤维细胞培养条件下，其生物性质与人iPS极为类似。本发明发现利用组蛋白脱乙酰酶抑制剂进行诱导，可以加快猴iPS的重编程，且表达较高水平的多能性因子。本发明能高效诱导猴iPS细胞，并推动iPS的临床应用研究。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及快速有效诱导性猴多能性干细胞的制备方法以及用于快速有效诱导性猴多能性干细胞的培养基。

背景技术

从植入前的胚胎中第一次提取出人类胚胎干细胞似乎产生了一个新的潜在的细胞来源。许多退行性疾病的植入疗法。在成人体内，胚胎干细胞可以保持和扩展在体外未分化的状态，保持多能性并具有向三个胚层细胞分化的能力。早在1981和1998年，猴和人的胚胎干细胞的建系成功，标志着再生医学的研究拉开了序幕。在未来的再生医学中，直接从患者体内产生多能干细胞是避免排斥反应的主要方法之一。最近证明4个多能因子足以将体细胞重新编程为胚胎样状态，被鉴定为诱导多能干细胞，迄今所获得的人IPS细胞与人胚胎干细胞在形态、增殖速率、基因表达谱、多能基因的表观遗传状态和多血统分化潜能等方面都有相似之处。通过对于胚胎干细胞自我更新和定向分化机制的研究，许多特异性的细胞类型(例如，神经细胞、心肌细胞等:)已经具备了成熟的分化方法的检测标准，这不仅有可能为患者提供未来治疗所需的匹配产品线，从而消除免疫抑制的需求，而且还可以为药物筛选产生具有疾病特征的多能干细胞。然而，胚胎干细胞真正从体外研究到进入临床应用还面临许多技术和伦理问题。

2007年，日本和美国的科学家报道了可将KLF4、OCT4、SOX2和C-MYC四种转录因子导入人的成纤维细胞，使其逆分化成具有胚胎干细胞特性的细胞，并将其命名为诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,iPS cells)。在这篇发表在《Cell》杂志上的文章中，研究者选取了与胚胎干细胞信号转导相关的24个基因作为候选基因，感染人成纤维细胞，并进行基因组整合，分别以细胞形态学特点、胚胎干细胞关键基因表达，及畸胎瘤的形成等方面特点作为iPS的鉴定指标。最终确定了Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc这四个转录因子，即可由正常体细胞转化成多能干细胞。这种基因诱导而产生的多能干细胞称iPS细胞。这种直接从已分化的细胞得到干细胞为胚胎干细胞领域甚至整个生命科学领域都带来了概念性的革新。我们可以病人的体细胞为来源得到病人特异的iPS细胞，这种iPS细胞又可以分化为具有功能的细胞、组织和器官，用于疾病治疗。这样的应用方式可以避免免疫相容性和伦理问题。自此，iPS细胞的诱导技术的出现也引起了人们对其生物医学应用的极大关注。

尽管iPS细胞的应用仍面临着两大问题：生物安全隐患和较低的诱导效率，近年来随着创新药物和新型医疗技术的发展，iPS细胞分化为免疫细胞(NK、T、巨噬细胞)、神经细胞、肝脏细胞、视网膜细胞等进行肿瘤、帕金森、重症肝衰竭、视网膜黄斑变性等疾病方面的治疗越来越成为一种可行性治疗手段。但由于缺乏遗传背景明确、实验方法稳定的实验动物(特别是猴)iPS的制备方法，iPS来源的细胞治疗技术的临床前安全性评价研究受到严重掣肘。因此，寻找能够提高猴iPS细胞制备方法和培养条件就成为非常重要的一环技术。

本发明针对现存技术中的问题，在猴iPS制备和培养方法上进行了广泛和深入的研究，最终完成本发明。

发明内容

为了提高猴iPS细胞的制备效率，本发明提供了一种诱导性猴多能干细胞的制备方法，该方法包括以下歩骤：

歩骤1，利用采用组织块贴壁培养法、胶原酶消化法、胶原酶与胰酶相结合的双酶培养法分离猴耳源成纤维细胞，将一个或多个干细胞多能性因子导入体细胞；

歩骤2，使用添加了蛋白脱乙酰酶抑制剂的培养基培养歩骤1中导入了干细胞多能性因子的猴耳源成纤维细胞；以及饲养层细胞的制备和传代；