[发明专利]靶核酸的检测方法

说明书

本发明涉及一种靶核酸的检测方法，其包含：将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼切断的步骤；将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤；通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤；其中，将第一侧翼切断的步骤及将第二侧翼切断的步骤通过用侧翼核酸内切酶将第一侧翼和第二侧翼切断来进行，侧翼核酸内切酶具有与嗜热古生菌(Thermococcus kodakarensis)KOD1株等的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有96％以上的序列同源性的氨基酸序列。

技术领域

本发明涉及靶核酸的检测方法。

背景技术

已知有基于靶核酸的检测的各种诊断方法。作为这样的诊断方法，例如有基于单核苷酸多态性(SNP)分析的体质诊断、基于体细胞突变分析的药剂(例如抗癌剂)的效果和副作用的预测诊断、基于病毒的DNA或RN A的检测的感染症的诊断等。在这些诊断用途中，靶核酸的存在比较低的情况较多，因此需要能够高精度地对靶核酸进行定量分析的方法。作为高精度地对靶核酸进行定量分析的方法，例如已知利用了数字测量的方法。

数字测量是如下的定量方法：将靶核酸等生物分子以概率达到1分子以下的方式稀释，比对给多个微小的反应容器，对各反应容器进行2值化(有/无伴随检测反应的信号)，由此对检测对象是否进入反应容器进行计数。在数字测量中，也能够检测1分子的生物分子，能够进行高精度的定量测定。例如，非专利文献1中公开了将ICA(Invasive CleavageAssay，侵入裂解分析)法与数字测量组合而成的靶核酸的检测方法。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：日本印刷学会誌，2017年，第54巻第6号，pp.377－382

发明内容

发明所要解决的课题

数字测量基于对各反应容器进行2值化(有/无伴随检测反应的信号)的情况，因此为了进行更高精度的定量测定，要求提高信号/噪声比(S/N比)。因此，本发明的目的在于提供一种提高了S/N比的靶核酸的检测方法。

用于解决课题的手段

本发明涉及一种靶核酸的检测方法，其包含：将由靶核酸、第一核酸和第二核酸形成的第一开裂结构的第一侧翼(flap)切断的步骤；将由第三核酸、被切断的第一侧翼和第四核酸形成的第二开裂结构的第二侧翼切断的步骤；以及通过检测被切断的第二侧翼来检测靶核酸的存在的步骤；其中，将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤通过用侧翼核酸内切酶将上述第一侧翼和上述第二侧翼切断来进行，所述侧翼核酸内切酶具有与选自由嗜热古生菌(Thermococcus kodakarensis)KOD1株、深海热球菌(Pyrococcusabyssi)GE5株、以及热自养甲烷嗜热杆菌(Metha nothermobacter Thermautotrophicus)Delta H株组成的组中的细菌的侧翼核酸内切酶的氨基酸序列具有96％以上的序列同源性的氨基酸序列。

本发明的检测方法中，第一侧翼的切断及第二侧翼的切断通过特定的侧翼核酸内切酶进行，因此与现有方法相比，S/N比提高。

在上述检测方法中，靶核酸可以是DNA。

在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在pH为7.5以上且9.0以下的条件下进行。pH在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。

在上述检测方法中，优选将上述第一侧翼切断的步骤及将上述第二侧翼切断的步骤在温度为55℃以上且70℃以下的条件下进行。当温度在该范围内时，S/N比的提高效果变得更显著。