[发明专利]模板乳化期间的逆转录

权利要求书

1.一种文库制备方法，所述方法包括：

制备包含用于逆转录的细胞和试剂的混合物；

涡旋所述混合物，其中在所述涡旋期间，所述混合物分配到水性液滴中，所述水性液滴各自包含零个或一个细胞，裂解所述细胞以将mRNA释放到所述液滴中，并且

逆转录酶将所述mRNA拷贝成cDNA；以及

将所述cDNA扩增成扩增子文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述混合物包含颗粒，并且其中在涡旋期间，所述颗粒模板化所述液滴的形成，其中使用涡旋器或通过移液进行所述涡旋以剪切所述混合物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒包括其中包含所述试剂的凝胶。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述混合物是水性的，并且所述方法包含在所述涡旋之前向所述混合物上添加油。

5.根据权利要求2所述的方法，其进一步包括在所述涡旋期间，将所述混合物加热到促进所述逆转录酶的活性的温度。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述温度介于约40℃与50℃之间。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒与包含3'poly-T区的捕获寡核苷酸连接。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述颗粒进一步包含cDNA捕获寡核苷酸，所述cDNA捕获寡核苷酸具有与所述mRNA的cDNA拷贝杂交的3'部分，其中所述3'部分包含基因特异性序列或六聚体。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒与捕获寡核苷酸连接，所述捕获寡核苷酸包含与在所述扩增步骤中使用的PCR引物同源的一个或多个引物结合序列。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在涡旋仪器上进行所述涡旋。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述涡旋仪器以介于约200rpm与700rpm之间的速率涡旋所述混合物。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述涡旋仪器包含加热器，所述加热器在涡旋期间加热所述混合物。

13.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒中的每个颗粒含有用于逆转录的所述试剂中的一些试剂。

14.根据权利要求2所述的方法，其中所述颗粒中的每个颗粒充当模板，以引发油中的水性单分散液滴的形成，其中每个液滴包括一个颗粒。

15.根据权利要求2所述的方法，其中在所述涡旋期间：所述混合物在约5秒到约50秒内分配到所述水性液滴中，并且然后所述细胞在约30秒到约几分钟内裂解，并且然后所述逆转录酶开始拷贝所述mRNA。

16.一种样品制备方法，所述方法包括：

在样品容器中制备包含核酸和聚合酶的水性混合物；

向所述样品容器中添加油；

摇动所述样品容器，以将所述水性混合物分配到被油包围的液滴中；以及

在所述摇动期间，用所述聚合酶合成所述核酸中的至少一个核酸的DNA拷贝。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸最初位于细胞中，并且所述摇动步骤形成含有所述细胞的液滴，所述方法进一步包括裂解所述液滴内的所述细胞以将所述核酸释放到所述液滴中。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述核酸包含mRNA，并且所述聚合酶包含逆转录酶。