[发明专利]模板乳化期间的逆转录

说明书

用于用逆转录酶在使得该逆转录酶在乳化期间开始产生cDNA的温度下乳化细胞和/或mRNA的方法。本公开提供了用于将mRNA逆转录成互补DNA(cDNA)同时将细胞分离到水性分区中的方法。本公开的方法提供了将mRNA中的信息非常快速地捕获到cDNA中，该cDNA比mRNA更稳定。当样品乳化成液滴时，紧接着产生cDNA。

技术领域

本公开涉及用于理解基因表达和生物学的工具。

背景技术

在活生物体中，遗传信息储存在DNA中。DNA中的基因被转录成信使RNA(mRNA)，其被翻译成蛋白质。蛋白质在活生物体中起着关键的功能和结构作用。例如，大多数酶由蛋白质组成，并且那些酶催化使人们保持存活的代谢反应。其也是将DNA拷贝成mRNA的酶。蛋白质也是结构性的，并且构成肌肉的基本纤维、头发的主要材料以及细胞骨架内的基本结构连接。本质上，所有此类蛋白质都是通过将mRNA翻译成蛋白质来产生的。事实上，一个mRNA可以充当用于合成蛋白质的多个拷贝的模板。

因为活细胞响应于不同的环境条件、营养物利用率以及甚至细胞内信号传导而改变，所以这些细胞在不同的时间需要不同的蛋白质。细胞改变任何给定mRNA是短寿命的能力是有益的。认为大多数mRNA分子具有以秒或分钟为单位测量的寿命。mRNA的本质性和短暂性对生物学理解提出了挑战。一方面，在给定时刻存在于细胞中的mRNA可以揭示关于细胞如何应答病原体或药物或应答年龄特异性发育改变的程度。另一方面，在从细胞的天然环境中去除细胞和研究存在的mRNA的任何尝试中，时间是至关重要的。那些mRNA在数秒或数分钟内开始降解。随着在实验室中花费时间来建立临床或研究测定，待研究的细胞的最佳分子成分开始衰退并且其所代表的信息丢失。

发明内容

本公开提供了用于将mRNA逆转录成互补DNA(cDNA)同时将细胞分离到水性分区中的方法。本公开的方法提供了将mRNA中的信息非常快速地捕获到cDNA中，该cDNA比mRNA更稳定。当样品乳化成液滴时，紧接着产生cDNA。本公开的方法利用颗粒，这些颗粒充当用于在单个管或容器中同时制备大量单分散乳液液滴的模板。通过将细胞添加到包含多个水凝胶模板颗粒的水性混合物中，将油分层到水相之上，以及涡旋或移液管，这些颗粒充当模板，同时涡旋或移液的剪切力使得形成油包水单分散液滴，其中每个液滴中具有一个颗粒。逆转录试剂可以包含在初始混合物中，从而允许逆转录酶在剪切水/油混合物的同时开始形成乳液。在液滴制备过程的第一阶段期间，紧接着从RNA制备cDNA保存了作为mRNA存在于原始细胞中的信息。本公开提供了用于成功地将mRNA逆转录成cDNA同时在单个管中将多个细胞分离成单分散液滴的合适的试剂和条件。

因为cDNA是在混合管中的乳液的同时制备的，所以重要的生物学信息不会由于活细胞中的RNA分子的短寿命而丢失。因为mRNA的信息被保存为cDNA，所以本公开的方法提供了用于在任何时间理解给定细胞的表型和基因表达的另外的有用工具。事实上，cDNA可以通过例如聚合酶链反应扩增成多个稳定的DNA扩增子，这些扩增子可以在各种条件或方法下储存或研究。本公开的方法非常适合于制备适用于在下一代测序(NGS)仪器上进行测序的DNA文库。

本公开的见解是，可以在促进cDNA合成的温度和/或混合速度下在单个管中制备多个液滴。例如，通过在约50℃和/或约500rpm下混合，方法可以成功地启动cDNA合成，同时在单个管中形成含有细胞的液滴，由此被分离成单独的水性分区。因此，本公开的方法为基础生物学、临床研究和患者测试提供了重要工具。