[发明专利]用于优化的干涉散射显微镜的方法和装置

说明书

一种通过干涉散射显微镜对样品成像的方法，该方法包括：使用至少一个光源对样品进行照射，样品被保持在包括反射表面的样品位置处，使得形成反射信号，反射信号包括来自所述光源的光以及由所述样品散射的光；在第一帧N₁的第一时间窗中检测输出光；在第二帧N₂的第二时间窗中检测输出光；计算比率测量信号R，R为N₁与N₂的比减去1；根据帧N₁和N₂估计比率测量运动特征S＝(S_x，S_y)，其中S被定义为比率测量图像，其是根据沿x和y移动给定的运动矢量m＝(m_x，m_y)的不变样品所测量的；将m估计为最一致矢量，使得使用S和m来近似R；以及根据R、S和M，计算校正的比率测量对比度图像R*。

技术领域

本发明涉及用于优化的干涉散射显微镜(Interferometric Scatteringmicroscopy，在此被称为IScat)的方法和装置。

背景技术

IScat已经成为一种强大的方法，其可用于具有独特的时空分辨率和低至单分子水平的无标记灵敏度的单粒子跟踪，并且还可用于通过质量光度法和质量成像法测定单粒子质量。

例如，在Kukura等人的“单个病毒的位置和方向的高速纳米跟踪(High-speednanoscopic tracking of the position and orientation of a single virus)”，自然方法(Nature methods)2009 6：923-935中，以及在Ortega Arroyo等人的“干涉散射显微术(IScat)：超快超灵敏光学显微术的新领域(interferometric scattering microscopy(iscat)：new frontiers in ultrafast and ultrasensitive optical microscopy)”，物理化学化学物理(physical chemistry chemical physics)，201214：15625-15636中均公开了IScat。

尽管具备相当大的潜力，但由于对定制显微镜、非常规相机和复杂样品照射的要求，限制了IScat的广泛应用，从而限制了IScat对小到单个分子的对象进行稳健和准确的检测、成像和表征的能力。

在我们之前的专利WO2018/011591中，我们公开了一种干涉散射显微镜，包括新型的、对比度增强的空间掩模，该空间掩模被配置为提高参照光场和散射光场的相对振幅。其中所描述的显微镜能够实现类似于常规IScat技术的灵敏度，但实现的复杂性和费用被大幅降低，使得可以通过简单的修改和包括空间掩模将常规显微镜配置为起到IScat的作用。

然而，对于本申请的发明人来说，使用该方法可获得的测量灵敏度的许多限制已经变得显而易见。

在IScat显微镜中，为了检测与边界结合的粒子所产生的信号，经常使用相邻帧之间的比率。因此，计算了一个比率测量对比度图像，其显示了在给定时间点之前和之后两个运行帧的像素强度的相对变化。

然而，如果样品在相邻帧之间移动，这可能会导致问题。由于样品运动还与像素强度的变化相关联，因此这些变化也会在比率测量图像中被检测到，并引起根据数据检测粒子和确定质量的问题。事实上，此项技术的高灵敏度意味着：即使在移动距离小于一个像素的情况下，来自粒子的信号也可能会被样品载体的运动所淹没。小到像素大小的1％的运动会产生与单个蛋白质具有相同振幅的信号。因此，即使是非常小的运动也会产生高度错误的信号。

当前用于校正亚像素级运动的方法包括：迭代图像配准、傅立叶变换和光流。这些方法不能直接应用于比率测量图像，并且也不能在千赫兹(kHz)帧速率下足够精确地实时执行。

本发明提供了用于校正样品运动的优化的IScat技术的方法和装置。本文公开的方法通过检测运动并将其从信号中减去来解决这个问题。