[发明专利]钙防卫蛋白测定

说明书

本文公开了用于检测并量化生物流体样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法；以及用于此类方法的单克隆抗体和测定试剂盒。该方法可以用于在患者中检测、监测和/或确定以炎症为特征或表现出炎症的疾病的状态或严重程度。

技术领域

本发明涉及用于检测和优选量化生物流体样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)生成的钙防卫蛋白片段的免疫测定方法，以及此类方法用于在患者中检测、监测和/或确定以炎症为特征或表现出炎症的疾病(诸如但不限于炎症驱动的疾病)的状态或严重程度的用途。本发明还涉及用于此类方法的单克隆抗体和测定试剂盒。

背景技术

钙防卫蛋白在细胞内，尤其是在中性粒细胞内表达，并且占中性粒细胞总胞质物质的约60％¹。钙防卫蛋白是TLR受体的配体，并且具有相对蛋白酶抗性²。中性粒细胞是来自骨髓细胞谱系的特化造血细胞，并且是来自先天性免疫系统的细胞亚群。中性粒细胞充当抵御病原体和细菌侵袭的第一道防线，并且因此在发炎的组织中也高度表达^3–5。

钙防卫蛋白可以在患有炎性肠病(IBD)的患者的粪便(粪便钙防卫蛋白)中进行测量¹，其中粪便钙防卫蛋白已被证明是用于区分IBD患者和肠易激综合征患者的稳健的夹心法-ELISA生物标志物^6–8。由于血清/血浆样品比粪便样品更容易处理，并且由于已经证明粪便稠度会影响粪便钙防卫蛋白水平，而且一天与一天之间甚至粪便与粪便之间的差异也很大，因此也已经对许多粪便钙防卫蛋白进行测试以查看它们是否也可以应用于血清/血浆样品。然而，钙防卫蛋白具有非常短的血浆半衰期(5小时)⁹，并且目前关于血清/血浆钙防卫蛋白及其作为IBD的适用生物标志物的可用数据存在争议^10–15。

中性粒细胞的激活导致中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular trap，NET)的产生，其中细胞分泌所有的其细胞核和胞质物质以试图捕获并削弱例如侵袭的细菌¹⁶。由于NET的形成，钙防卫蛋白和人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)将被分泌到发炎的组织中¹⁷。结果，组织和细胞外基质(ECM)和其他分泌的蛋白质将被HNE降解，这将导致包含蛋白质片段的新表位的生成^18,19。另外，还已经证明HNE与IBD中的组织炎症有关²⁰。已证明在来自IBD患者和临床前模型的血清中测量了包含胶原蛋白降解和形成的蛋白质片段的新表位，并与临床疾病参数相关^18,21–25。

炎症诱导的钙防卫蛋白和HNE的释放也发生在其他疾病中。慢性阻塞性肺病(COPD)和特发性肺纤维化(IPF)的特征是广泛的炎症和细胞外基质(ECM)的重塑，并且这可能导致肺功能随着时间的严重下降^34,35。中性粒细胞在受COPD影响的肺中非常丰富，并引起持续的组织伤害³⁶。IPF患者通过纤维化变化经历类似的持续性损伤，其中已经在IPF患者的支气管肺泡灌洗液中看到HNE释放的增加³⁷。中性粒细胞是炎症的细胞反应者，并且能够释放蛋白酶NE和蛋白质钙防卫蛋白二者³⁸。

炎症也使得倾向于癌症的发展并促进肿瘤发生的所有阶段。癌细胞以及周围的基质细胞和炎性细胞参与精心设计的相互作用，以形成炎性肿瘤微环境(TME)³⁹。免疫检查点抑制剂(诸如但不限于抗PD-1疗法)是一类用于治疗癌症诸如转移性黑色素瘤的药物。然而，与转移性黑色素瘤患者中对于抗PD-1疗法和其他此类免疫检查点抑制剂的反应和抗性相关的外周生物标志物代表了未满足的医疗需求。高中性粒细胞活性也与免疫检查点抑制剂失效有关，部分原因是NET的释放已被证明可以保护肿瘤细胞免受细胞毒性攻击。如上所述，HNE和钙防卫蛋白是主要的NET成分。

发明内容