[发明专利]结合蛋白质的细胞外囊泡的制造方法

权利要求书

1.一种制造源自MSC的与蛋白质结合的细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括以下步骤：

-从包含MSC的细胞培养基中纯化EV，其中所述纯化通过对所述培养基进行至少一个过滤步骤进行；接下来

-对所述至少一个过滤步骤的滤液进行浓缩的步骤，其中所述EV通过切向流过滤(TFF)装置中的切向流过滤(TFF)进行浓缩；并且

-其中在所述TFF步骤期间，EV与在所述TFF装置内部或在与所述TFF装置流体连接并且将所述EV从所述TFF装置转移到其中的容器中的一种或多种外源蛋白质结合。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在浓缩所述EV期间补充所述蛋白质至所述TFF装置或连接的容器。

3.如权利要求1所述的方法，其中，在浓缩所述EV期间补充钙至所述TFF装置或连接的容器。

4.如权利要求3所述的方法，其中，将所述钙和所述蛋白质在所述TFF或连接的容器中混合，并与存在于所述TFF装置或连接的容器中的所述EV一起温育。

5.如权利要求4所述的方法，其中，对与蛋白质结合的所述EV进行洗涤、重新浓缩并随后在TFF装置外进行收集。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质选自膜联蛋白、硫氧还蛋白和乳凝集素。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述蛋白质是膜联蛋白V、Trx或Mfge8，优选是重组膜联蛋白V、Trx或Mfge8。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述TFF装置的截流分子量为100kDa。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在包含纯化的人血清白蛋白的细胞培养基中培养和扩增所述MSC。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述培养基中白蛋白的浓度为1g/l至5g/l。

11.一种包含治疗有效量的与蛋白质结合的EV的组合物，其中，所述蛋白质选自膜联蛋白、硫氧还蛋白或乳凝集素的组。

12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述蛋白质是膜联蛋白V、Trx或Mfge8，优选是重组膜联蛋白V、Trx或Mfge8。

13.如权利要求11或12所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括钙，优选浓度为1mM至10mM。

14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物进一步包含人白蛋白，优选浓度为每升所述组合物10g至20g。

15.如权利要求14所述的组合物，其中，所述蛋白质是膜联蛋白V，其中所述组合物进一步包含钙，并且其中结合EV的膜联蛋白V与白蛋白的比例为1:90000至1:3000000。

16.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包含人白蛋白和钙，比例为每mg钙25mg至750mg白蛋白。

17.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中，所述EV的尺寸为50nm至300nm。

18.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物配制用于静脉内、鼻内、气管内、经口、皮下、肌内、经皮或透皮施用于患者。

19.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其用于治疗或预防用途。

20.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其应用于预防或治疗肺部疾病。