[发明专利]结合蛋白质的细胞外囊泡的制造方法

说明书

本发明涉及一种制造与源自间充质基质细胞(MSC)的蛋白质结合的细胞外囊泡(EV)的方法，所述方法包括以下步骤：‑从包含MSC的细胞培养基中纯化EV，其中所述纯化通过对所述培养基进行至少一个过滤步骤进行；接下来‑对所述至少一个过滤步骤的滤液进行浓缩的步骤，其中所述EV通过TFF装置中的切向流过滤进行浓缩；和‑其中在所述TFF步骤期间，EV与在所述TFF装置内部或在与所述TFF装置流体连接并且所述EV从所述TFF装置转移到其中的容器中的一种或多种外源蛋白质结合。本发明还涉及一种包含治疗有效量的与蛋白质结合的EV的药物组合物，及其用途。

技术领域

本发明涉及一种制造与源自间充质基质细胞(MSC)的蛋白质结合的细胞外囊泡(EV)的方法。本发明还涉及一种包含治疗有效量的与蛋白质结合的EV的组合物，和其用途。

背景技术

EV是由细胞自然释放的脂双层分隔的颗粒，但是EV与细胞不同，不可复制。EV的直径范围从接近物理上可能的最小单层脂质体(大约20-30纳米)至大到10微米以上，但是绝大多数的EV小于200nm。他们搬运大量蛋白质、核酸、脂质、代谢物、甚至是源自亲代细胞的细胞器。据认为迄今为止研究的大多数细胞能释放EV，包括一些细菌、真菌和被细胞壁包围的植物细胞。已经提出了多种EV亚型，根据大小、生物发生途径、转运物、细胞来源和功能进行了不同的定义，从而导致了历史上的不同命名，包括外泌体、微泡和核外颗粒体等术语。

EV可以用于治疗目的，例如向病变组织和细胞输送核酸或其他转运物。与这种日益增长的兴趣并行的是公司的成立和资助计划(这些公司和资助计划聚焦于开发EV作为生物标志物或疾病疗法)、国际细胞外囊泡学会(ISEV)的成立，以及致力于该领域的科学期刊(the Journal of Extracellular Vesicles)的成立。

随着将EV用于治疗用途的兴趣日益增长，对临床级EV的需求也已经增加。为了应用于临床，需要以可复制和可控的方式生产EV。为了确保生产的各批次相同且质量一致，用于制造包含EV的组合物的良好操作规范(GMP)至关重要。当涉及细胞衍生疗法时，GMP尤其困难。在可以广泛临床上应用EV之前，需要克服多种问题。开发以可靠和可重复量化的方式生产、储存和处理临床级EV的平台仍然是一个挑战。将源自MSC的EV类疗法引入临床之前，源自MSC的EV类药物和后续的临床实验需要解决多种技术、科学、监管和机制问题。

因此，需要在国际协调会议(ICH)2020GMP质量规范的GMP条件下，可以以稳定和可重复的方式生产临床级的源自MSC的EV的方案。而且还需要具有良好稳定性和具有商业吸引力的保质期的EV类产物。此外，需要生产临床级源自MSC的EV，其具有结合在其膜或表面上的所需蛋白质。这些蛋白质可以增强EV的功能和治疗价值。

已经将EV修饰以表达多种治疗分子(WO 2019/198 077)或装载siRNA、寡核苷酸或向导RNA(Reka Agnes Haraszti等人,2018)。装载可以通过将供体细胞与转运分子一起温育或通过超声处理、挤出、冻融循环和对EV电穿孔来进行(DLuan等人,2017)。WO2021/084274A1公开了一种包含具有结合到外表面的脂质结合蛋白的EV的组合物。

已经报道了EV的纯化方法，但是可扩展性仍然还是问题。Nordin Joel Z等人，2019公开了使用切向流过滤(TFF)来纯化EV作为大规模生产EV的推定方法。该方法采用劳动密集型结合洗脱尺寸排阻色谱法。Zheng Zhao等人，2019提出了一种通过微流控细胞培养芯片生产表面抗原工程化EV的方法。后者价格昂贵且不易获得。

该领域仍需高效生产可以用于治疗用途的与蛋白质结合的EV的方法。

发明内容

本发明及其实施方式用于提供一种或多种上述缺点的解决方案。为此，根据权利要求1，本发明涉及用于制造源自MSC的与蛋白质结合的EV的方法。更具体地，所述方法包括以下步骤：