[发明专利]使用已敲除CEL1A基因的木霉属真菌菌株生产蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株的各种用途。本发明特别涉及一种通过其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株生产蛋白质的方法，包括至少两个步骤：‑第一步：在至少一种碳生长底物存在下在分批阶段中生长，和‑第二步：在包含至少乳糖和第二种糖的组合物的存在下，在分批补料阶段生产蛋白质，所述组合物中的乳糖含量占所述组合物中总糖含量的约0至30重量％，特别是5至30重量％。

技术领域

本发明涉及一种通过(i)一种其中cel1a基因已被敲除的属于木霉属的真菌菌株，和(ii)优化的诱导剂组合物生产蛋白质的方法。

背景技术

属于木霉属，特别是里氏木霉的真菌菌株，如今主要用于生产酶。这些酶，例如纤维素酶，实际上用于将纤维素或木质纤维素生物质水解成单糖。因此，丝状真菌产生的酶可用于第二代生物燃料的生产链，甚至可用于源自(木质)纤维素生物质的糖类的生物基产品。

为了改进第二代生物燃料或生物基产品的生产，已经由此提出改进纤维素酶的生产。

例如，专利EP448430B1描述了通过里氏木霉的优化的纤维素酶工业化生产。该生产是根据分批补料方案(不提取补料)，使用含有乳糖作为诱导蛋白质生产的糖的补料溶液进行的。该发酵方法包括两个步骤：第一步是在存在过量碳源的情况下的真菌生长，以及第二步是由于以优化的流速(分批补料模式)将诱导剂添加到向培养基中的酶生产。这些步骤在生物反应器的液体介质中，同时搅拌并在氧气存在下进行，因为真菌是严格好氧的。专利EP2744899B1中描述了生产纤维素酶的优化方法的另一个例子。

传统上，特别是在实验室中，第二步中使用的补料溶液仅包含乳糖。然而，在工业上，乳糖太昂贵而不能单独用于补料溶液中。因此，已经考虑了各种解决方案来减少所使用的乳糖的量。

例如，Jourdier等人已经表明可以用其他较便宜的糖(例如葡萄糖和/或纯化木糖)代替部分乳糖(参见Jourdier等人，Biotechnology for Biofuels 2013,6:79)。在本研究中，作者分析了葡萄糖和/或木糖对通过高产里氏木霉菌株(CL847菌株)分泌酶的影响。因此，本研究得出结论，在源自高产模型菌株RutC30的工业菌株CL847中，诱导能力与补料溶液中存在的乳糖含量呈正相关：乳糖含量越高，诱导效果越好。

国际申请PCT/FR2011/000350还描述了一种生产纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的方法，在生产阶段使用包含40至65重量％的葡萄糖、21至25重量％的乳糖和10至39重量％的木糖，和因葡萄糖的分解代谢物抑制而灭活的里氏木霉真菌组合的组合物。

其中xyn1和xyn2木聚糖酶基因的启动子序列的调控元件已插入到纤维素酶启动子中的里氏木霉的修饰菌株也已描述于国际专利PCT/FR2016/050950中。因此，在所述修饰菌株中，基因可被其自身的诱导底物如乳糖、纤维二糖或纤维素诱导，但也可被木聚糖酶诱导底物如木聚糖、木糖等诱导。

因此，现有技术中已经描述了用于改进丝状真菌的纤维素分解酶的生产和由此改进的生物基产品和第二代生物燃料的发酵方法和菌株。

然而，仍然需要尽可能高效的用于生产蛋白质，特别是纤维素分解酶的新方法，特别是允许足够的生产同时使用尽可能少的乳糖以降低成本。