[发明专利]基因多态性检测方法

权利要求书

1.一种基因多态性检测方法，其用于检测采自被检者的基因组DNA中存在的载脂蛋白E的基因多态性，所述方法包括下述的步骤1～3：

步骤1：使DNA从采自被检者的包含上皮细胞的外分泌液或粘液中游离而制作包含该DNA的被检体；

步骤2：向包含该DNA的被检体中添加下述(1)～(3)并进行混合，(1)PCR酶；

(2)用于扩增载脂蛋白E基因的核酸片段的PCR引物对，其包含编码载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基(Cys或Arg)的密码子；以及，

(3)荧光标记探针组，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第112位的氨基酸残基为野生型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第112位的氨基酸残基为突变型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同，

或者，所述荧光标记探针组为具有包含编码载脂蛋白E的第158位的氨基酸残基为野生型的Arg的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针与具有包含编码该第158位的氨基酸残基为突变型的Cys的密码子、并且能与载脂蛋白E基因的核酸片段结合的寡核苷酸的荧光标记探针所组成的组，并且用于标记的荧光色素彼此不同；

步骤3：对所述混合物进行PCR，从其PCR产物测定与该被检者的载脂蛋白E的第112位或第158位的氨基酸残基对应的荧光强度。

2.根据权利要求1所述的基因多态性检测方法，其中，在所述步骤1中，使用表面活性剂和蛋白酶K使DNA游离。

3.根据权利要求2所述的基因多态性检测方法，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向所述被检体中还添加包含氯化钾、氯化镁和dNTP混合物的Tris盐酸缓冲液并进行混合。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，向所述被检体中还添加下述物质并进行混合，所述物质是与吸附于PCR酶的生物来源的负电荷物质和吸附于DNA的生物来源的正电荷物质这样的抑制PCR的物质结合、从而中和该负电荷物质和正电荷物质的PCR抑制作用的物质。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述外分泌液或粘液为唾液。

7.根据权利要求6所述的基因多态性检测方法，其中，利用棉棒、脱脂棉、吐出、DNA采集试剂盒来采集所述唾液。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的基因多态性检测方法，其中，所述PCR引物对为下述的序列号1与序列号2、或序列号3与序列号4、或序列号5与序列号6、或序列号7与序列号8所示的碱基序列所成的对，

正向：5’-CAAGGAGCTGCAGGCGG-3’···(序列号1)

反向：5’-CAGCTCCTCGGTGCTCTG-3’···(序列号2)

正向：5’-GGCGCAGGCCCGGCT-3’···(序列号3)

反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号4)

正向：5’-CGCAAGCTGCGTAAGCG-3’···(序列号5)

反向：5’-CGCGGATGGCGCTGAG-3’···(序列号6)

正向：5’-CGTAAGCGGCTCCTCCG-3’···(序列号7)

反向：5’-CGGCGCCCTCGCGG-3’···(序列号8)。