[发明专利]使用基于毛细管的免疫测定系统进行的用于糖缀合物的分析方法

说明书

本发明提供了用于鉴定和定量复杂糖缀合物组合物的分析方法，特别是用于分析包含至少4种糖缀合物的样品中的糖缀合物的分析方法。

本发明涉及用于鉴定和定量复杂糖缀合物组合物的分析方法，具体地涉及包含至少4种糖缀合物的样品中的糖缀合物的分析，特别是在糖缀合物导致产生可能包含未完全分辨的峰的宽信号的情况下。

监管机构对生物制药制造商施加的压力越来越大，要求他们展示令人满意的程序来理解、测量和控制基于糖缀合物的药物中的糖基化。然而，复杂糖缀合物组合物(诸如糖缀合物疫苗)的分析(即，这种组合物内各个糖缀合物的鉴定和定量)是一项具有挑战性的任务。这种分析通常涉及劳动密集型方法，诸如酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)或手动斑点印迹法Western(manual dot blot Western)。

这种方法通常涉及大量的人工劳动。

此外，经常使用的ELISA没有提供关于每种糖缀合物的不同糖基化变体的信息。

最近的替代方法是基于毛细管的免疫测定方法，即毛细管蛋白质印迹，除了样品制备步骤外，该方法可以是完全自动化的[参见例如Rustandi等人，Applications of anAutomated and Quantitative CE-Based Size and Charge Western Blot forTherapeutic Proteins and Vaccines.2016.Tran N.,Ta-verna M.(编辑)CapillaryElectrophoresis of Proteins and Peptides:Methods and Protocols.Methods inMolecular Biology，第1466卷，第197-217页]。这种方法可以显著减少人工劳动量以及整体分析时间。

在此类方法中，样品的不同组分在毛细管内被分离并借助于特异性抗体被检测到。

Hamm等人[Analytical Biochemistry 2015,478:33-39]描述了使用基于毛细管的免疫测定法来鉴定糖缀合物疫苗组合物内的各个糖缀合物。然而，他们并没有报道所述组合物内糖缀合物的定量，而仅仅提出进行定量的可能性。因此，该文献也没有描述用于产生校准曲线的校准样品的测量。为了实现糖缀合物疫苗组合物内所有糖缀合物的准确定量，必须能够准确地对与每个单独糖缀合物相对应的整个信号进行积分。因此，该文献仅公开了糖缀合物的鉴定测试。因此，它也没有公开允许对导致产生包含未完全分辨的峰的宽信号的糖缀合物进行定量的计算机程序。此外，没有公开生物缀合物的分析。

Minsker等人[Vaccine 2020,38:7155-7174]描述了使用毛细管蛋白质印迹来鉴定和相对定量糖蛋白。在该方法中，检测糖蛋白的蛋白质组分，并将所得信号用于确定糖蛋白的相对丰度。因此，该方法不包括用于产生校准曲线的校准样品的测量，也不包括感兴趣糖蛋白的绝对定量。此外，没有提供关于数据分析的细节。相反，它指出“按默认供应商建议应用所有未指定的设置”。

Markely等人[Biotechnology progress 2015,32(1):235-241]描述了一种用于相对定量不同唾液酸化形式的糖蛋白以便监测细胞培养期间唾液酸化的相对变化的等电聚焦免疫测定方法。因此，该文献既没有描述校准曲线的产生，也没有描述糖缀合物的绝对定量。使用Compass软件根据制造商的指南进行该文件中的数据分析。

然而，一般来讲，导致产生宽信号(特别是包含未完全分辨的峰的宽信号)的分析物的定量仍然是一个挑战[参见例如Castle等人，J.Biol.Chem.2019,294(8):2642-2650中的图5D]。