[发明专利]抗体构建体的表达技术

说明书

本发明涉及抗体构建体的表达载体设计。抗体构建体的不同多肽链在相同的开放阅读框内编码，通过2A肽接头彼此连接。此表达载体设计实现了抗体构建体的均匀表达和正确组装。

技术领域

本发明涉及重组蛋白质生产领域。提供了抗体构建体的新表达策略。特别地，提供核酸产物用于产生具有若干不同多肽链的抗体构建体，其中多肽链在由2A肽隔开的相同开放阅读框内编码，从而导致生成分离的多肽链。因此，实现了抗体构建体的均匀表达和正确组装。

背景技术

双特异性抗体是结合两个不同表位的抗体。最常见地，它们是通过将针对第一表位的重链-轻链对与针对第二表位的另一个重链-轻链对配对来构建的。这样的抗体构建体是本领域熟知的。产生双特异性抗体的一种方法是所谓的旋钮入孔(knob-into-hole，KiH)技术，例如，由Ridgway等人(1996)Protein Engineering[蛋白质工程]9(7):617-621所描述的。本文中，通过用较小的氨基酸取代较大的氨基酸来修饰第一重链以显示孔样结构，并且使用氨基酸取代(其中较小的氨基酸由较大的氨基酸替换)来修饰第二重链以在重链:重链界面的对应位点处显示旋钮样结构。由于有利于旋钮和孔重链的配对，因此形成双特异性抗体，即由两条不同轻链和两条不同重链组成的异四聚体蛋白质。

然而，在宿主细胞中仍然会发生抗体的错误组装，尤其是由于轻链与错误的重链错配或两条相同的重链配对，或缺失一条多肽链的不完整构建体。此外，双特异性抗体的多肽链通常以不同的量表达，例如，因为多肽链的表达盒以不同的量表达，导致mRNA水平失衡。这增加了错误组装的抗体构建体的量。

错误组装的抗体会降低生产工艺的总得率，并且在纯化工艺期间特别难以去除。

因此，现有的生成双特异性抗体的方法可能不能以足够具有成本效益的方式提供足够的总得率、纯度和产品质量，从而无法大规模生产用于临床开发和商业化。此外，蛋白质链的任何修饰固有地增加了诱导抗药物抗体的风险。因此，仅需要极少的蛋白质工程的方法在临床上可能是有利的。

鉴于上述情况，本领域需要提供改善的策略来产生双特异性抗体和其他抗体构建体，从而得到较高得率和比率的正确组装的抗体构建体。

发明内容

本发明诸位发明人已发现，如果至少一些不同多肽链使用自切割肽接头(例如所述多肽链之间的2A肽)在相同开放阅读框内编码，则可以生成包含三条或更多条不同多肽链的抗体构建体(如双特异性抗体或抗体融合蛋白质)，且具有显著增加的功效。发明人证明这一方法可提供mRNA水平的均衡表达，从而也导致更均衡的蛋白质水平。此外，来自一个mRNA的不同多肽链的翻译在宿主细胞中近距离发生。因此，所产生的抗体构建体被正确组装，并且防止了多肽链的不必要错配以及一些多肽链的过量产生。因此，本发明可使由宿主细胞表达的正确形成的抗体构建体的比率增加，并且从而使期望产物的总得率和纯度增加。发明人能够证明根据本发明的方法对于若干不同抗体构建体的优点，与传统方法相比，这些构建体均显示出更高的蛋白质正确组装率。

因此，在第一方面，本发明涉及由一个或多个载体核酸组成的核酸产物，该一个或多个载体核酸编码包含至少三条不同多肽链的抗体构建体，其中抗体构建体包含抗体重链，并且其中抗体构建体的至少两条不同多肽链在相同开放阅读框内编码，其中在所述开放阅读框内编码的连续多肽链通过包含2A肽的肽接头连接。

在第二方面，本发明提供包含根据第一方面的核酸产物的宿主细胞。

在第三方面，本发明提供用于产生抗体构建体的方法，该方法包括以下步骤：

(a)提供根据第二方面的宿主细胞，

(b)在允许产生抗体构建体的条件下，在细胞培养物中培养宿主细胞，

(c)从细胞培养物中获得抗体构建体，以及

(d)任选地加工抗体构建体。