[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法

说明书

本发明涉及利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法，更具体地，涉及通过将包含靶向马铃薯来源的马铃薯多酚氧化酶2(Solanum tuberosum Polyphenol Oxidases 2，StPPO2)基因的单向导RNA(sgRNA)的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)复合物转导至马铃薯原生质体来制备褐变得到抑制的基因组编辑马铃薯植株的方法。由于本发明的方法没有外来基因的插入，只有与自然变异无法区分的微小变异，因此可与需要消耗巨大的成本及时间来评估安全性及是否具有环境危害性的转基因生物(Genetically Modified Organism，GMO)作物不同，其有望节省成本及时间。

技术领域

本发明涉及一种利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法。

背景技术

近来，消费者的食品购买方式转向天然产品偏好及健康导向，同时，随着单人家庭及核心家庭的增加，对具有新鲜度及便利性的轻度加工作物(minimally processedcrops)的需求正在增加。由于这种轻度加工作物在生产阶段中经过清洗、剥皮及切割等过程，因此消费者可在购买后无需经过预处理过程即可直接使用的优点。

马铃薯作为轻度加工作物之一，在加工过程中因剥皮及切割导致的表面暴露于空气中及细胞壁破坏，容易发生酶促褐变现象(enzymatic browning)。

在包括马铃薯在内的植株中发生这种酶促褐变现象的主要原因是多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)蛋白，多酚氧化酶蛋白是一种含有Cu²⁺的酶，通过氧化细胞中存在的多酚化合物来转化为左旋多巴(L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)，L-DOPA)，左旋多巴转化为多巴醌后，经氧化聚合反应引起形成深褐色黑色素的褐变现象。

众所周知，这种褐变反应不仅使轻度加工作物呈现出令人不快的颜色及气味，而且还会降低营养价值。并且，由于像这样在轻度加工作物的储存及流通过程中发生褐变的产品的商品性降低导致经济损失，因此有必要抑制褐变。

最近的基因组编辑技术显示了使用各种类型的位点特异性核酸酶(nuclease)在所需基因组DNA位置诱导基因突变的可能性。其中，CRISPR/Cas9系统作为与植物及其他许多有机体相关的强大的基因组编辑工具而周知。该系统的优点是精确有效地将突变引入靶位点。并且，表明基因编辑作物与通过现有传统育种技术开发的作物相比没有差异。

另一方面，日本公开专利第2019-507595号中公开了“一种显示减少的损伤诱发性表面变色的植物”，韩国公开专利第2016-0087651号中公开了“一种防止褐变的有色马铃薯及防止有色马铃薯褐变的方法”，但没有记载本发明的“一种利用CRISPR/Cas9系统的褐变抑制马铃薯植株的制备方法”。

发明内容

技术问题

本发明鉴于如上所述的要求而导出，本发明人为了抑制褐变，通过利用CRISPR系统代替普通的杂交育种或基因修饰方法来编辑马铃薯多酚氧化酶2基因，从体外培养的无菌马铃薯幼苗中分离原生质体之后，通过聚乙二醇(PEG)介导的转染(transfection)方法引入核糖核蛋白(RNP)复合物(StPPO2sgRNA+Cas9)后，通过引入的原生质体的细胞再生及分化来最终选择马铃薯多酚氧化酶2基因被编辑的个体，并且从选择的基因编辑植株中选择多酚氧化酶2(PPO2)蛋白活性及褐变现象得到抑制的马铃薯品系，从而完成了本发明。

技术方案