[发明专利]D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种利用相互作用多肽对制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的方法，包括如下步骤：

1)向磷酸钠缓冲液中加入多肽SpyCatcher或SnoopCatcher，之后加入适量环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h，反应产物用PBS缓冲液洗涤数次；

2)将洗涤后的反应产物加入甘氨酸缓冲液中，25℃恒温振荡反应12～24h，反应产物用超纯水清洗数次；

3)将清洗后的反应产物加入磷酸钠缓冲液中，之后加入可与所述SpyCatcher专一结合的多肽SpyTag或可与所述SnoopCatcher专一结合的多肽SnoopTag，25℃恒温搅拌反应3～12h，获得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶；

其中，多肽对SpyCatcher/SpyTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；多肽对SnoopCatcher/SnoopTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的方法，其特征在于：步骤1)中，所述SpyCatcher或SnoopCatcher与所述环氧树脂的加量比例按质量比为：每20～35mg蛋白对应加入1g环氧树脂；步骤3)中，所述清洗后的反应产物与所述SpyTag或SnoopTag的加量比例按摩尔比为1:1。

3.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的方法，其特征在于：步骤1)中，所述环氧树脂经过如下预处理：将环氧树脂置于磷酸钾缓冲液中，25℃恒温下150rpm振荡1h，振荡处理重复2～3次，最后用超纯水清洗环氧树脂；所述磷酸钾缓冲液由0.1mol/L的K₂HPO₄和0.1mol/L的KH₂PO₄按体积比15～16:1混合配制而成。

4.根据权利要求1所述的制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的方法，其特征在于：步骤2)中甘氨酸缓冲液的浓度为3mol/L，pH为7.4；步骤1)和步骤3)中的所述磷酸钠缓冲液的浓度为2mol/L，pH为6.4～7.4；步骤1)中用于洗涤反应产物的PBS缓冲液的pH为7.4。

5.一种利用权利要求1制备获得的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶催化制备D-阿洛酮糖的方法，包括如下步骤：

1)将固定化酶加入到含有D-果糖的反应体系中，于50～60℃反应1.5～2.5h；反应体系中的D-果糖浓度为100～500g/L，反应体系中固定化酶的催化剂用量为：每20～25g D-果糖对应加入0.01g固定化酶；

2)反应完成后，用pH7.4的PBS缓冲液洗涤固定化酶，之后将固定化酶置于pH7.4的PBS缓冲液中，4℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的制备D-阿洛酮糖的方法，其特征在于：步骤1)中，所述含有D-果糖的反应体系为水果自发酵液，其D-果糖的浓度为100g/L。