[发明专利]D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用

说明书

D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶固定化酶的制备方法及其应用。本发明提供了用于制备D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶的相互作用多肽对SpyCatcher/SpyTag，以及SnoopCatcher/SnoopTag的核苷酸序列、利用以上四种多肽制备D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶的方法以及利用固定化酶生产D‑阿洛酮糖的方法。利用本发明方法制备获得的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶同时保持了酶活高和稳定性高的特点，重复多次使用后酶活无明显衰减。同时，利用本发明提供的多肽对进行D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶固定化酶的制备，过程中无需使用戊二醛(交联)及其它有毒害的化学试剂，同时也不涉及昂贵的试剂和复杂的设备，整个制备过程无毒害且成本低廉。

技术领域：

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的制备方法，及其在转化D-阿洛酮糖方面的应用。

背景技术：

D-阿洛酮糖是稀有糖家族的重要成员，是一种新型的低能量甜味剂。因具有较高的甜度和较低的能量，D-阿洛酮糖被认为是一种理想的甜味剂和蔗糖的有效替代品，可用于开发低热量食品饮料。同时，D-阿洛酮糖可以发生美拉德反应，有助于提升食品品质，可以完美发挥传统的糖的作用。

生物合成法生产D-阿洛酮糖，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-阿洛酮糖。D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase，DAE)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是生产稀有糖的良好催化剂，以D-果糖为底物生产附加产值高的D-阿洛酮糖。随着D-阿洛酮糖的市场需求量的日益增加，高效的生物催化剂的开发对其工业应用至关重要。然而，D-阿洛酮糖3-异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖过程中，由于酶无法重复利用，使得该工艺成本较高，且水溶性的酶不易从反应系统中分离出来，不利于控制和自动化生产。酶的固定化技术可以增加酶稳定性的同时使酶可以反复多次使用，但是传统的酶固定化方式容易导致酶多个位点和载体结合，破坏酶的天然构象或者出现位阻效应而阻碍底物进入到酶的活性位点，致使固定化酶活性大幅度下降。

发明内容：

鉴于以上问题，本发明的目的在于提供一种D-阿洛酮糖3-差向异构酶固定化酶的方法，包括用于固定化酶制备的蛋白质，使得制备的固定化酶能够在保持较高酶活性的同时维持良好的稳定性，实现批次循环使用。

本发明技术方案具体如下：

本发明提供一种利用相互作用多肽对SpyTag/SpyCatcher，或SnoopTag/SnoopCatcher制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶的方法，包括如下步骤：

1)向磷酸钠缓冲液中加入SpyCatcher或SnoopCatcher，之后加入适量环氧树脂，25℃恒温振荡反应12h，反应产物用PBS缓冲液洗涤数次；

2)将洗涤后的反应产物加入甘氨酸缓冲液中，25℃恒温振荡反应12～24h，反应产物用超纯水清洗数次；

3)将清洗后的反应产物加入磷酸钠缓冲液中，之后加入可与所述SpyCatcher专一结合的多肽SpyTag或可与所述SnoopCatcher专一结合的多肽SnoopTag，25℃恒温搅拌反应3～12h，获得D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶；

其中，多肽对SpyCatcher/SpyTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；多肽对SnoopCatcher/SnoopTag的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

进一步地，步骤1)中，所述SpyCatcher或SnoopCatcher与所述环氧树脂的加量比例按质量比为：每20～35mg蛋白对应加入1g环氧树脂；步骤3)中，所述清洗后的反应产物与所述SpyTag或SnoopTag的加量比例按摩尔比为1:1。