[发明专利]一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法

说明书

本发明公开了一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法，该方法包括样本前处理、样本破壁处理、样本核酸提取和样本核酸文库构建步骤，所述样本为无细胞体液样本，所述样本破壁处理是将样本置于匀浆机中进行3个循环的破壁处理。

技术领域

本发明涉及宏基因组检测领域，具体涉及一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法。

背景技术

感染性疾病是世界范围内导致人类死亡的主要原因之一。传统的病原体检测方法主要受限于通量低，时间长，灵敏度低。新兴的宏基因组二代测序可一次性检测样本中的未知、罕见、不典型等所有病原体，提示耐药基因和毒力因子，且具有最高的阴性预测值，适用于疑难危重症病例病原体的快速诊断、新发和罕见病原体的发现，以及“排除”感染。

随着宏基因组测序技术的不断发展，其在临床疑难感染性疾病诊断方面的应用越来越广泛，广泛用于败血症、脑膜炎、脑炎等感染性疾病。其中对于血流感染患者，如果使用全血进行核酸提取及建库，虽然包括了最全面的病原信息，但是大量的人源基因会掩盖了极微量的病原微生物信息，同时游离短片段容易丢失，降低了有效病原体检出。如果用血浆中的游离核酸检测，虽然克服了全血样本中大量红细胞、血红素、白细胞干扰的检测，但是也会有部分血液细胞内病原微生物的丢失，这在一定程度上降低了准确性。对于其他无细胞体液样本(例如脑脊液)存在大量游离核酸和短片段，核酸含量一般很低，导致建库失败。目前市场上用于无细胞体液样本的检测方法，提取效率偏低，灵敏度不高，建库失败率高，并且常规破壁流程对无细胞体液样本的损耗较大，特别是病毒，急需针对这类样本的一整套检测流程。

因此，开发一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法，提高游离核酸和低浓度的核酸检测成功率，提高真菌和胞内菌检出同时，保证病毒完整性，对于宏基因组的检测具有重要意义。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于宏基因组测序的游离核酸建库方法。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述基于宏基因组测序的游离核酸建库方法包括样本前处理、样本破壁处理、样本核酸提取和样本核酸文库构建步骤，所述样本为无细胞体液样本，所述样本破壁处理是将样本置于匀浆机中进行3个循环的破壁处理。

优选地，所述无细胞体液样本为血浆或脑脊液。

优选地，当所述样本为血浆时，在进行样本前处理过程中在血浆样本中加入全血，且全血与血浆的体积比为1:50至3:50。

更优选地，所述全血与血浆的体积比为2:50。

优选地，样本核酸提取时，向样本中加入蛋白酶K进行孵育。

更优选地，所述蛋白酶K孵育温度为37℃，孵育时间为2h。

优选地，所述样本破壁处理时，将匀浆机的破壁循环参数设置为：6m/sec，60s on，5min off。

优选地，所述样本核酸文库构建针对不同无细胞体液样本，优化不同的低浓度核酸建库流程。转座酶建库适用于低浓度核酸样本，例如脑脊液等这类含有短片段，核酸含量低的样本，操作简单，建库成功率更高，耗时更短。但是转座酶建库不适用于片段短至100-200bp的样本，血浆游离核酸片段主要集中在100-200bp，因此采用酶切法建库。

进行宏基因组测序时即采用前述构建的样本文库进行上机测序。

下面对本发明作进一步说明：

在本发明中，待测样本可以选自无细胞体液(血浆、脑脊液)。

在本发明中是专门针对无细胞体液样本的整套检测流程，核心创新点包括样本特殊处理，游离核酸提取和低浓度核酸的建库方案等，提出了更完整，准确的一套检测方法。