[发明专利]一种马来酸顺反异构酶突变体

说明书

本发明公开了一种马来酸顺反异构酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的马来酸顺反异构酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该突变酶的温度稳定性相比野生酶有了较大的提高，同时该突变体具有更好的pH稳定性。将构建得到的马来酸顺反异构酶突变体与天冬氨酸酶AspA在大肠杆菌中偶联表达，并以马来酸为底物生产L‑天冬氨酸，转化率可达94％以上，具有广阔的工业生产应用前景。

技术领域

本发明涉及一种马来酸顺反异构酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

马来酸顺反异构酶(EC 5.2.1.1，Maleate cis-trans Isomerase，MaiA)是一种能够将马来酸(顺丁烯二酸)催化转化成富马酸(反丁烯二酸)的异构酶，能够在碳碳双键不断裂的情况下，实现顺式丁烯二酸向反式丁烯二酸的异构化，属于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族。由于具有催化反应pH范围宽泛、较低的Km值以及较高平衡常数的特点，马来酸顺反异构酶被认为是可用于工业生产富马酸的有潜力的生物催化剂之一。马来酸顺反异构酶广泛存在于一些可吸收利用马来酸的细菌中，如假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)和节杆菌属(Arthrobacter)等。但多数马来酸代谢菌中此酶的活力较低、热稳定性较差，制约了马来酸顺反异构酶在工业生产中的应用。

粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)来源的马来酸顺反异构酶在室温有较好的热稳定性，酶活力也相对其他菌株来源的要高。2013年，王亚等人将从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶编码基因连接到pET24a载体上，并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达(王亚,崔文璟,周丽,等.粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质[J].食品与生物技术学报,2014)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种马来酸顺反异构酶突变体，以氨基酸序列如SEQID NO.4所示的序列为亲本序列，对亲本序列第96位和100位中的一位或两位进行取代。

在一种实施方式中，编码所述亲本的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，将第96位的谷氨酰胺取代谷氨酸，将第100的丙氨酸取代为甲硫氨酸。

在一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述马来酸顺反异构酶突变体的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

在一种实施方式中，所述载体包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列载体。

优选地，以pET24a(+)为载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述马来酸顺反异构酶突变体或含有所述基因的微生物细胞。

在一种实施方式中，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母为宿主细胞。

优选地，以大肠杆菌BL21宿主细胞；更优选地，以敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌BL21为宿主细胞。

本发明的第五个目的是提供一种生产所述马来酸顺反异构酶突变体的方法，将表达所述马来酸顺反异构酶突变体的微生物细胞接种于2×YT培养基中，35～37℃培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG于37℃诱导14～16h。